花粉特异表达的微管结合蛋白SB401的特性分析

【摘要】：微管结合蛋白对微管骨架的组织和功能调控有重要的作用。马铃薯(Solanum berthaultii)花粉中特异表达的SB401蛋白具有类似于动物微管结合蛋白MAP1B微管结合域的特征重复序列,其中的KKEE基序(motif)也存在于微丝成束蛋白Villin头部(headpiece)的微丝结合域中,因此推测其具有与微管、微丝结合的能力,可能是一种新的植物花粉特异表达的微管结合蛋白。 本研究构建了SB401的原核表达载体,并通过原核表达,分离、纯化到SB401的融合蛋白,对该蛋白的微管和微丝的结合、成束以及调控微管和微丝的效应进行了系统的研究。共沉淀实验以及激光共聚焦显微镜和电镜观察结果表明:SB401蛋白可与微管特异结合,结合的摩尔比为tubulin dimmer:SB401=1;0.4;SB401蛋白诱导taxol稳定的微管形成微管束,其成束能力依赖于SB401蛋白的浓度,随SB401蛋白浓度升高,微管束从单束到交连成网团状,成束现象越来越显著;微管束中微管与微管之间由SB401蛋白紧密粘结,微管与微管之间的距离约6-8 nm,微管之间发现明显的丝状橫桥结构存在。SB401蛋白在溶液中主要以单体、二聚体、四聚体形式存在,三种形式都可与微管结合,诱导微管成束。通过免疫印迹、GST融合蛋白沉降技术、350 nm浊度测定和荧光显微镜观察等方法证明SB401蛋白与微管蛋白(tubulin)特异结合。在SB401蛋白与微管蛋白的共聚合体系中,SB401蛋白能够促进或抑制微管的体外聚合,在高温(37℃)或高浓度条件下,SB401蛋白与微管蛋白迅速结合,降低了聚合反应体系中游离微管蛋白的浓度,抑制微管的聚合;在较低温度(28℃)和低浓度条件下,SB401蛋白优先与微管结合,诱导微管成束稳定微管,促进微管的聚合。细胞免疫荧光的实验也证明,SB401蛋白在花粉管中与微管共定位。 SB401蛋白也与微丝特异结合,结合的摩尔比为G-actin:SB401=1:0.22。SB401蛋白诱导微丝形成微丝束,但微丝成束需要的时间比微管成束时间长。SB401蛋白对微丝的聚合动态没有影响。在微管和微丝同时存在的条件下,SB401蛋白可与微管微丝同时结合,形成微管一微丝束,使微管微丝共定位。微管、微丝与SB401蛋白的结合有竞争性,SB401蛋白与微管的亲和力高于微丝,SB401蛋白优先与微管结合。 本论文证明了SB401蛋白是一个新发现的植物花粉特异表达的微管结合蛋白,具有诱导微管成束,调节微管聚合特性的功能;此外,SB401蛋白也可以结合微丝,诱导微丝成束。因此,SB401蛋白可能在植物花粉发育和花粉管生长等生理过程中有重要的作用。