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小盐芥C_2H_2类锌指蛋白基因ThZF1的克隆及其功能研究

许守明  
【摘要】:世界各地的农业生产都面临着日趋恶化的环境威胁,干旱和盐的威胁因其广泛性而首当其冲。十年来,人们广泛利用拟南芥作为遗传模式植物,对胁迫的信号应答和调控途径,以及转基因工程等方面开展了深入研究,为阐明植物胁迫耐受性形成的分子机理,加快作物遗传改良的步伐奠定了基础。盐生的拟南芥的亲缘物种小盐芥,近来开始作为一种盐生遗传模式植物,用于植物耐盐分子遗传学等方面的研究,这将有助于我们更好地理解植物胁迫耐性的相关机理。 锌指类蛋白是一类重要的转录因子,在动植物的生长发育中均起着重要作用。近来,在拟南芥中发现了多个锌指蛋白,其中包括C_2H_2类的锌指蛋白比如AZFs等,又称为TFⅢA类型锌指或经典锌指,是真核生物转录因子中研究最多的一种与DNA结合的结构模式。它们参与了植物发育以及胁迫应答的调控过程,在植物对逆境的适应性调节反应中扮演了重要角色。但是,在盐生植物中尚未见此类基因的序列及蛋白功能的报导。 本研究采用EST策略并结合RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术,成功地从盐生模式植物小盐芥的幼苗叶片中克隆了一个C_2H_2类型的锌指蛋白基因ThZF1。并对其表达特征,转录因子特性及转基因植物中的功能进行了初步研究。 研究结果表明,小盐芥了TZF1 cDNA编码蛋白由276个氨基酸组成,推测其分子量为30 kD,等电点8.27。它与拟南芥AZF2有最高的同源性,同源性达79%。推测的小盐芥ThZF1蛋白没有跨膜区,为水溶性蛋白。它包含两个C_2H_2锌指结构域,每个C_2H_2锌指结构域都具有植物特有的序列QALGGH,是典型的TFⅢA型锌指蛋白。N端的B-Box可能是其核定位(NLS)序列,另外还发现了L-Box,DNL-Box等结构序列。 利用Northern杂交和RT-PCR技术分析表达差异,结果表明ThZF1受干旱和盐的诱导。GFP融合瞬时表达实验显示它定位于细胞核。 ThZF1有激活酵母HIS基因的作用,凝胶阻滞分析表明ThZF1能特异结合EP2元件序列。所有这些结果说明,ThZF1可能是一个EP2结合型转录因子,暗示它是一个潜在的植物转录因子。烟草瞬时表达实验表明,ThZF1能诱导AtEPSP1:GUS的表达,说明它可能直接作用于EPSPs类下游基因的启动子而调控后者的表达。 为了进一步研究ThZF1的功能,用农杆菌介导法将其基因转入拟南芥,得到转基因的拟南芥azf2突变体互补植株,并研究了转基因互补植株与突变体和野生对照的生长以及对盐和干旱的耐受性差异。结果表明,转基因的植株在缺少水分时开花较早;离体叶片失水较慢,表现较好的保水能力;另外,在转基因互补植株中,可能的下游基因AtEPSP1的表达受到诱导。由于EPSPs类基因参与莽草酸代谢途径,并且与逆境胁迫密切相关,因此JThZF1可能通过这种方式影响了植物的生长发育并提高了逆境耐受性。 本研究首次从盐生模式植物小盐芥幼苗叶片中克隆了一个C_2H_2类的锌指蛋白基因,并对其性


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