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两种拟南芥65KDa微管结合蛋白的功能分析

毛同林  
【摘要】:微管结合蛋白在细胞微管骨架的动态和组织结构中起着重要的作用。近年来,随着新的植物微管结合蛋白不断被发现,使我们对植物中微管结合蛋白有了进一步的认识,研究表明这些微管结合蛋白对微管骨架的动态特征和组织结构都有重要的调控功能,并进一步的对植物细胞的形态、分化和生长发育等生理过程产生重大影响。 MAP65是一类植物所特有的微管结合蛋白,MAP65蛋白家族最初在烟草悬浮细胞中发现,后来在胡萝卜悬浮细胞中也找到了此类微管结合蛋白。通过对其基因组数据库分析表明,拟南芥中MAP65家族由9个同源基因组成。最近研究发现它们部分成员在细胞中的分布各不相同,故推测它们的功能也有所不同。 本论文对拟南芥9个成员中的AtMAP65-1和AtMAP65-6这两个同源异型体展开研究。序列比对显示,二者的氨基酸序列的相似性为41%。首先用RT-PCR的方法分别获得了这两个成员的全长cDNA。分别构建了融合GST标签的原核表达载体,并纯化了蛋白,以便进行这两种AtMAP65的生物化学特性的研究。 与taxol稳定微管的共沉淀实验结果显示,AtMAP65-1和AtMAP65-6可与微管结合,具有一般微管结合蛋白的基本特性。浊度法实验显示AtMAP65-1在体外可以促进微管聚合,沉淀分析实验也进一步证实了这一点。并且它可以明显缩短微管聚合的限速时间,具有促进微管成核的效应。它可以降低微管聚合的临界浓度,从11μuM降低到5μM。而浊度法实验显示AtMAP65-6对微管聚合没有任何影响。这说明二者对微管的动态可能存在着不同的调节作用。 激光共聚焦显微镜结合电子显微镜观察显示,二者诱导所形成的微管结构也各不相同。AtMAP65-1可以使微管形成粗大的束状结构,荧光标记蛋白实验显示AtMAP65-1在整个微管上均匀分布;电镜切片观察表明这些微管束是由AtMAP65-1在微管间形成的规则性的直径在25—30nm的“横桥”连接而成的。这种束状结构可以被一定的盐浓度所打破,分散为单根微管。AtMAP65-6则使微管形成网络状结构,荧光标记蛋白和电镜切片实验显示这种网络状结构是由AtMAP65-6在微管与微管的交叉处形成部分“横桥”结构所构成的;并且这种网络状结构对一定的盐浓度是稳定的。在对聚合微管的稳定功能方面的实验显示,AtMAP65-1可以在低温条件下稳定已聚合的微管,并且可以抵抗溶液对它的稀释作用。而AtMAP65-6则没有这样的效应。 拟南芥悬浮细胞免疫荧光定位显示,与AtMAP65s其他成员不同,AtMAP65-6是与线粒体共定位的,这为进一步研究其生理功能提供了基础。对AtMAP65-6蛋白过量表达植株的观察显示,它在植物生长后期,可明显促进侧根的产生。 论文的研究结果证明了拟南芥AtMAP65家族成员在对微管特性的调控方面有显著的差异,表明其在细胞中可能有不同的功能,这为进一步AtMAP65蛋白的生理功能提供了重要的依据。


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