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阿维菌素类药物多残留分析方法的研究

何继红  
【摘要】:阿维菌素类药物(Avermectins, AVMs)属于大环内酯类抗生素,由于其优良的驱虫活性而广泛应用于畜牧业。然而作为高毒化合物,AVMs在动物组织中的残留不容忽视。本研究旨在制备针对AVMs的抗体,以此为核心试剂建立检测动物组织中AVMs残留的ELISA快速筛选方法和免疫亲和色谱-高效液相-荧光检测(IAC-HPLC-FLD)技术。 将阿维菌素(Avermectin, AVM)、伊维菌素(Ivermectin, IVM)和多拉菌素(Doramectin, DOR)进行结构改造,制备半抗原4"-o-succinoylAVM、4"-o-succinoyl IVM和4"-o-succinoyl DOR。质谱鉴定其分子量为995.7(M+Na~+)、997.8(M+Na~+)和998.6(M-H~+),与目标产物分子量一致。将半抗原与载体蛋白BSA偶联,制备免疫抗原,免疫动物制备抗体。半抗原与OVA偶联,制备包被抗原。免疫抗原与包被抗原紫外扫描光谱鉴定,载体蛋白与半抗原的结合比1:3.4-1:31.6。 筛选出的抗AVM的多克隆抗体对AVMs有较高的交叉反应:埃普里诺菌素(Eprinomectin, EP)为145.4%、AVM为100%、IVM为25.0%、DOR为12.3%。以此抗体为基础建立ELISA检测方法,可同时检测牛组织中的AVM、IVM和EP残留。确定包被抗原的包被浓度为1:5000,抗体的工作浓度为1:5000,酶标二抗的工作浓度为1:2000。标准曲线:y=-45.613x+81.191,R~2=0.9951,IC_(50)=4.8ng/mL,线性范围为1.1-21.9ng/mL。空白牛肝脏组织中以20、50和100ng/g浓度添加时,AVMs回收率为53.8-80.4%,变异系数为3.4-17.9%;空白牛肌肉组织中以5、10和20ng/g浓度添加时,AVMs回收率为70.9-108.6%,变异系数为3.7-17.1%。 国内外率先研制出可同时检测牛肝脏和牛肌肉组织中的AVM、IVM和EP残留的ELISA试剂盒。本研究对试剂盒的各溶液配方进行选择,并确定试剂盒的技术参数:试剂盒的灵敏度(IC_(50))为3.0-7.0ng/mL,空白牛肝脏组织最低检测限为8.4-9.6ng/g,空白牛肌肉组织最低检测限为0.5-0.8ng/g。该试剂盒中抗体对AVM、IVM、EP和DOR的交叉反应率分别为100%、25.0%、145.4%和12.3%。试剂盒的准确度和精密度实验符合要求,试剂盒的保存实验证明,该试剂盒可在2-8℃保存6个月。 国内外率先制备了可同时检测AVM、IVM、DOR和EP残留的高容量的IAC柱,AVM、IVM、DOR和EP的动态柱容量分别为3531、3542、3543和3284ng/mL gel,绝对柱容量分别为495、499、493和460ng/mg IgG。IAC柱在一个月的时间内重复使用15次后,AVMs的动态柱容量仍能达到1300ng/mL gel。 建立了IAC-HPLC-FLD检测方法,可同时检测动物组织中的AVM、IVM、EP和DOR残留。以5、10、50和100ng/g的浓度水平添加时,空白牛肝脏组织4种药物添加回收率为79.4-113.8%,变异系数为1.1-19.4%;牛肌肉组织中4种添加药物回收率为77.3-119.5%,变异系数为1.5-18.9%。方法的检测限为0.8ng╱g。


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