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犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究

柏亚铎  
【摘要】:病毒囊膜与宿主细胞膜的融合是囊膜病毒入侵宿主细胞的关键步骤。其过程涉及病毒囊膜表面蛋白与宿主细胞膜表面蛋白的构象变化和相互作用。对反转录病毒、纤丝病毒、正粘病毒和副粘病毒等的研究表明,其囊膜表面融合蛋白的七肽重复区HR1和HR2相互作用形成六螺旋束是引发膜融合的关键。其中,副粘病毒六螺旋束结构已经很清楚,但其它相关区域的功能还没有定论。对SARS冠状病毒和鼠肝炎冠状病毒(MHV)的研究表明冠状病毒也可能采用与其它囊膜病毒类似的膜融合机制。此外,副粘病毒膜融合过程中,融合蛋白的融合肽(FP)、HR3等区域被证明与融合蛋白的构象变化有关。本论文对副粘病毒科的犬瘟热病毒和冠状病毒科的犬冠状病毒膜融合机制进行了初步研究。采用搭桥PCR的方法扩增了犬瘟热病毒HR1、HR2、HR3和FP基因及犬冠状病毒HR1和HR2基因,分别克隆到pGEX-6p-Ⅰ表达载体中,用GST融合表达系统在大肠杆菌中获得了大量融合表达蛋白,将融合蛋白用GST-3C蛋白酶酶切并纯化,然后对其进行一系列蛋白质结构与功能学研究。圆二色谱及分子筛实验结果表明犬瘟热病毒和犬冠状病毒的HR1和HR2蛋白都能形成稳定的富含α螺旋的三聚体结构,说明犬瘟热病毒和犬冠状病毒与副粘病毒科和冠状病毒科其它成员采用相似的膜融合机制。犬冠状病毒在七肽重复区有14个氨基酸插入,不同于SARS-Cov和MHV,但不影响其形成六螺旋束结构的功能。在病毒合胞体抑制实验中,加入体外表达的犬瘟热病毒HR2蛋白后,能有效的抑制犬瘟热病毒在Vero细胞上产生的合胞体病变,而加入体外表达的犬瘟热病毒HR1蛋白后,则不能抑制犬瘟热病毒在Vero细胞上产生的合胞体病变;首次证明体外表达的犬瘟热病毒HR2蛋白能特异性地抑制犬瘟热病毒入侵宿主细胞,而犬瘟热病毒HR1蛋白则没有这种抑制活性。交叉抑制实验表明,犬瘟热病毒重组HR1和HR2蛋白不能抑制同属的麻疹病毒对Vero细胞的入侵。利用ExPASy系列生物学软件对犬瘟热病毒融合肽(FP)和三个七肽重复区的功能域分析表明FP和HR3都有较明显的疏水趋势,HR1与HR2既有亲水区又有疏水区。圆二色谱分析表明FP富含α螺旋,HR3呈无规则卷曲,蛋白体外结合实验表明,HR1与HR2区域都可以与HR3区域结合,不能与FP区域结合。病毒合胞体抑制实验表明,体外表达的犬瘟热病毒HR3蛋白能特异性地抑制犬瘟热病毒入侵宿主细胞,而体外表达的犬瘟热病毒FP蛋白则没有抑制活性。


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