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荷斯坦奶牛细胞因子基因的克隆、表达及重组蛋白的应用

张灿  
【摘要】:本研究从荷斯坦奶牛的外周血淋巴细胞中经ConA刺激提取总RNA,通过RT-PCR的方法克隆了IL-2、IL-6和GM-CSF三个基因,连接载体T-easy,测序结果显示:IL-2与已登录的基因序列完全相同;IL-6和GM-CSF与GneBank中的序列存在点变异。氨基酸序列分析表明三种细胞因子α螺旋在50%以上,有1-2个糖基化位点。 从PMD-18/VP1质粒中亚克隆FMDV抗原基因VP1,构建原核表达质粒pGEX-6p-1/VP1;亚克隆IL-2、IL-6和GM-CSF三个成熟肽基因,分别构建原核表达质粒pGEX-6p-1/BoIL-2,pGEX-6p-1/BOIL-6,pGEX-6p-1/BoGM-CSF;分别构建VP1基因与1-2个细胞因子基因共表达质粒 pGEX-6p-1/BolL-2/VP1,pGEX-6p-1/BolL-6/VP1,pGEX-6p-1/BoGM-CSF/VP,pGEX-6p-1/BoIL-2/IL-6/VP1,pGEX-6p-1/BoIL-2/GM-CSF/VP1,基因之间用linker连接,分别在大肠杆菌RS21中表达,30℃ IPTG诱导表达出相应蛋白:蛋白以包涵体的形式存在,表达量占菌体总蛋白的37%以上,纯化后蛋白纯度达到90%以上;生物活性测定结果表明,IL-2对小鼠的胸腺细胞有刺激活性,GM-CSF对小鼠的骨髓细胞有刺激活性。 将豚鼠随机分为17组,每组5只,将表达的重组蛋白免疫各组,每隔2周免疫一次,共免疫3次。每次免疫后2周采血分离血清,ELISA测定血清抗体效价;用中和抗体阻断试剂盒测定中和抗体:末次免疫后2周分离脾脏淋巴细胞,用MTT法进行T细胞增殖试验;通过半定量RT-PCR检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10表达水平;试验结束前三天进行迟发型超敏反应试验。豚鼠试验结果表明,与生理盐水对照组比较,免疫组血清IgG抗体水平显著升高,T细胞增殖反应显著增强,抗原特异性迟发型超敏反应(DHT)强烈,Th1型和Th2型细胞因子表达量都有不同程度的升高。各免疫组之间比较,两种细胞因子与VP1联用的融合蛋白和混合蛋白的四个免疫组免疫效果最好;单个细胞因子与VP1联用的六个免疫组效果次之,VP1、VP1+佐剂和灭活苗组与以上六组效果相当。在各免疫组中,共表达蛋白组和混合蛋白组免疫效果相当,没有明显的差别。中和试验结果表明,BOIL-2,BOIL-6组没有产生明显的中和抗体,其他各组都能刺激产生高水平的中和抗体;与VP1组比较,BoGM-CSF,BoIL-2/VP1,BolL-6/VP1,BoGM-CSF/VP,BoIL-2+VP1,BoIL-6+VP1,BoGM-CSF+VP,BoIL-2/IL-6/VP1,BoIL-2+BoIL-6/VP1,中和抗体水平较高,但没有达到显著差异,BoIL-2/GM-CSF/VP1,BoIL-2+BoGM-CSF/VP1免疫组中和抗体水平显著增高;与灭活苗组比较,BoIL-2/GM-CSF/VP1,BoIL-2+BoGM-CSF/VP1免疫组刺激产生的中和抗体滴度和灭活苗组中和抗体滴度相当。通过ELISA试验、T细胞增殖试验、中和抗体试验、迟发型超敏反应试验以及半定量PCR试验检测三种细胞因子作为分子免疫佐剂与VP1联用的效果,试验结果表明用VP1免疫,GM-CSF作为分子佐剂的效果最好:IL-2比IL-6的佐剂效果好;两种细胞因子联合的佐剂效果比单个细胞因子的佐剂效果好。


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