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植物次生物质对棉铃虫细胞色素P450s的诱导及CYP6B6基因的克隆与表达

刘小宁  
【摘要】:本论文以棉铃虫Heficoverpa armigera(Hubner)为对象,研究了槲皮素、2-十三烷酮、单宁酸等植物次生物质组合诱导对棉铃虫细胞色素P450s含量和活性的影响。明确了槲皮素和2-十三烷酮对棉铃虫P450s活性诱导的时间效应和剂量效应、槲皮素对棉铃虫不同组织总mRNA含量的影响以及植物次生物质对CYP686基因表达量的影响。对棉铃虫P450 CYP686基因进行了克隆和序列分析,并在原核细胞中进行了表达。 采用饲料添加法,用2-十三烷酮和槲皮素处理棉铃虫6龄幼虫48h后,两种植物次生物质对中肠P450s含量诱导具有累加效应,而对脂肪体P450s含量诱导表现为累加或拮抗作用。 利用毛细管气相色谱法灵敏度高,样品用量少,分辨率高的特点,建立了一个用于检测棉铃虫幼虫中肠和脂肪体细胞色素P450s O-脱甲基活性的小型反应体系(875μL),其中含0.1 mol/L,pH 7.8的Tris-HCl缓冲溶液,0.5μmol NADPH,7.5μmol MgCl_2,0.085% BSA,0.157mmol对硝基苯甲醚及2.08mg/mL酶液。 槲皮素和2-十三烷酮对棉铃虫中肠和脂肪体P450s O-脱甲基活性具有明显的诱导作用。组合诱导也得到相似的结果。当两种植物次生物质浓度为0.5 mg/mL时,对中肠和脂肪体P450s O-脱甲基活性诱导倍数均达到最大,分别为2.63和3.88倍。虽然两种植物次生物质对活性的诱导不存在互作增效关系,但是随浓度增加其活性有增加的趋势。 诱导的时间和剂量效应表明,当槲皮紊浓度为0.1 mg/mL时,中肠利脂肪体P450s的诱导活性随时间是先降低后增强,到48h达到最大(分别为对照的2.03倍和2.4倍),然后降低到正常水平;而槲皮素浓度为0.5 mg/mL时,诱导活性仅有一个高峰,发生在48 h,诱导倍数分别是2.8和2.79。2-十三烷酮对P450s诱导效应与槲皮素不同,2-十三烷酮对脂肪体P450s活性诱导与对照相比从4-48 h均为诱导增强,48 h后表现为诱导抑制。除2-十三烷酮浓度为0.1 mg/mL,处理时间为4 h和36 h时对中肠P450s活性为诱导增加之外,其余各处理时间点的活性和对照相比差异不显著。 研究了槲皮素对棉铃虫中肠利脂肪体总mRNA比含量影响的时间效应,结果表明在处理5 h、24 h和36 h时,槲皮素对中肠总mRNA含量具有明显的诱导增加作用。脂肪体总mRNA的量诱导组与对照相比没有显著差异。 用半定量RT-PCR检测植物次生物质对CYP686基因表达的影响,表明槲皮素对中肠和脂肪体的CYP686基因的表达量、单宁酸对脂肪体CYP686基因表达量没有明显的诱导作用。单宁酸对中肠CYP686基因的表达量具有明显的诱导作用。2-十三烷酮对中肠和脂肪体两个组织部位的CYP686基因表达量均具有明显的诱导作用。 依据已发表的棉铃虫CYP686基因设计2对引物,用RT-PCR的方法从棉铃虫中肠和脂肪体中分别克隆出P450的全长基因,生物信息学分析结果表明该基因为CYP686基因(注册号 AY950636和AY950637)。


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