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枯草芽孢杆菌B53的分离鉴定及产聚γ-谷氨酸的研究

惠明  
【摘要】:聚γ-谷氨酸(γ-PGA)主要是由一些芽孢杆菌产生的一种水溶性的胞外氨基酸聚合物。近年来被作为高吸水性材料、增稠剂、药物载体、生物絮凝剂及重金属吸附剂等广泛地应用于农业、食品、医药、化妆品及水处理等领域中,是一种具有极大开发价值和广阔应用前景的新型多功能高分子材料。本文从γ-PGA产生菌的筛选及鉴定、发酵条件优化及合成机制、菌种选育、γ-PGA的提纯及理化因素对其分子结构的影响、γ-PGA的应用等方面进行了研究。主要研究结果如下: (1)从76个样品分离得到的231株产芽孢细菌中筛选出一株聚γ-谷氨酸生产菌芽孢杆菌B53,其所产聚合物最大吸收波长为212nm,分子量集中在570~669kD之间,呈多分子量聚集体存在;从细胞形态、生理生化及遗传特征上分析鉴定B53菌株为枯草芽孢杆菌。 (2)B.subtilis B53合成γ-PGA的适宜碳氮源是甘油、柠檬酸、谷氨酸及硫酸铵,K_2HPO_4及Ca~(2+)、Fe~(3+)对γ-PGA的合成有显著的促进作用。通过正交试验和回归分析得出B53菌株合成γ-PGA的适宜培养基组成(g/L):L-Glu 20,CTA 9.86,Glycerol 80.36,(NH_4)_2SO_4 7,MgSO_4·7H_2O_(0.5),FeCl_3·6H_2O_(0.02),K_2HPO_4 0.89,CaCl_2 0.03,MnSO_4·H_2O 0.3。种子液培养24h,接种量4%(V/V),装液量50mL/300mL三角瓶,初始pH6.5,在37℃,150r/min摇床培养84h,γ-PGA的产量达到26.67g/L。5L发酵罐分批发酵试验表明:在发酵过程中菌体形态与聚合物结构有明显的变化:同柠檬酸和谷氨酸的消耗相比,甘油的代谢比较快,在甘油消耗比较快的阶段伴随γ-PGA的快速合成;γ-PGA的分子量在发酵54h以前基本没有变化,但之后分子量范围逐步变宽;分批发酵产量达18.61g/L。补料发酵试验发现,在发酵中期添加适量甘油及在发酵培养基中添加20~100U/mL的青霉素或10μg/L的生物素都可有利于γ-PGA产量的提高,而添加表面活性剂(如Tween 20、SDS)则不利于γ-PGA的合成。 (3)通过细胞融合技术选育出枯草芽孢杆菌B53与谷氨酸棒杆菌B9的稳定融合株R162,该菌株在以葡萄糖和硫酸铵为碳氮源的培养基上γ-PGA的产量比B53提高一倍以上(有多糖合成)。通过~(60)Co γ射线辐照选育出γ-PGA高产突变株F2-28,其发酵产量比B53提高了82.31%。 (4)当发酵液中γ-PGA含量人于20g/L,离心除菌后添加发酵液体积2.5倍的95%乙醇可以得到较好的提取效果;对γ-PGA发酵液采用超滤浓缩可以节约乙醇的用量,离心除菌及超滤浓缩要消耗大量能量。酸化或加热处理可明显降低发酵液的黏度,从而降低离心或超滤操作能耗,但酸化或热处理会使γ-PGA的分子结构发生变化,分子量降低。γ-PGA在pH值中性下比较稳定,pH5或pH8,容易发生降解,这是pH值改变引起发酵液黏度降低的主要原因。 (5)采用超声波、紫外线及~(60)Co γ射线辐照处理可以对γ-PGA进行分子修饰,对低分子量聚γ-谷氨酸的生产具有参考作用。Ca~(2+)、Cu~(2+)与Zn~(2+)等金属离子可与γ-PGA发生络合作用。 (6)γ-PGA对高岭土、Ca(OH)_2、Mg(OH)_2表现出较强的絮凝活性,采用0.6g/L的γ-PGA溶液对高岭土的絮凝活性可达到90%以上。K~+、Fe~(2+)、Mg~(2+)及Ca~(2+)具有明显的促絮凝作用,而Al~(3+)、Fe~(3+)则起削弱作用。CaCl_2浓度超过2g/L及介质溶液维持pH值中性都有利于γ-PGA提高絮凝活性。另外,γ-PGA可制备成水凝胶用作涂膜材料,对水果蔬菜的保鲜有一定作用。


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