药食源芽孢杆菌的分类鉴定及枯草芽孢杆菌H110抑菌特性研究

【摘要】：已有研究者对乳酪、口服药品、极端环境和土壤来源芽孢杆菌进行了分类和资源调查研究,但尚未有对中药源芽孢杆菌进行分类和资源研究的报道。通过分类研究揭示药食源芽孢杆菌的生物多样性及其系统发育地位,对深入发掘、保存及合理利用芽孢杆菌种质资源有重要的理论价值和现实意义。本文采用数值分类、16S rDNA全序列分析等分类方法,对分离自中药和食品的芽孢杆菌进行了分类鉴定,掌握它们的表型特征和系统发育学关系,初步建立药食来源的芽孢杆菌菌种资源信息库;同时,筛选出一批对6株病原细菌和7种植物病原真菌有拮抗作用的芽孢杆菌,其中5株有较强抑菌活性,测定了这5株菌的部分蛋白特性。此外,对菌株H110产抑菌蛋白进行纯化和分子量测定,并研究了该菌对苹果梨采后青霉病和黑斑病的抑制效果。 对836株来自255种中药和32种食品的芽孢杆菌菌株进行了104个表型特征的测定,并在此基础上进行数值分类,结果表明:在75%的相似性水平上,测定菌株被分成7个群。对数值分类聚类群1-7的中心菌株进行了基于16S rDNA全序列的系统发育学分析,并与GenBank中的已知菌进行比较,确定了各群的系统发育学地位。将结果与Ash等人1991年所做的芽孢杆菌16s rRNA系统发育图相比较,结果表明,群1、2、3、4、6和7对应的中心菌株H285、H24、H53、H128、V362和V382均位于基因群Group1中;群5的中心菌株H84位于基因群Group2中。 基于16S rDNA序列所做的系统发育分析表明,药食源芽孢杆菌各聚类群隶属丁芽孢杆菌属。群1和群2的中心菌株H285和H24同Bacillus cereus位于一个分支中,它们同Bacillus cereus的相似性分别为93%和92%。群3和群4的中心菌株H53和H128同Bacillus vallismortis、Bacillus amyloliquefaciens聚在一起。群6和群7的中心菌株V382和V362同Bacillus subtilis位于一个分支中,它们同Bacillus subtilis的相似性分别为93%和96%。位于Group2的中心菌株H84,同Bacillus fusiformis和Sporosarcina globispora聚在一个分支中,同这两个种的相似性分别为97%和90%。 以7株植物病原真菌作为指示菌,筛选出29株具有广谱拮抗作用的芽孢杆菌,其中以H110抑菌活性最强。枯草芽孢杆菌H110产粗蛋白经Sephadex~(TM) G-75柱层析后,得到两个蛋白峰,峰Ⅰ有很强的抑菌活性,峰Ⅱ基本无活性。采用SDS-PAGE变性电泳检测到活性蛋白H110-Ⅰ有两条蛋白带,分子质量分别为50kD和29kD。以H110为生防菌株,测定了它对苹果梨青霉病和黑斑病的抑制效果。该菌的4种处理(培养液、滤液、菌悬液和蛋白粗提液)对这两种真菌病害均有抑制作用,防病效果是由菌体和胞外抗菌蛋白协同作用的结果,其中起主要作用的是抗菌蛋白。