番茄中乙烯信号转录因子LeERF1和LeERF2调控机制研究

【摘要】：植物中内源激素乙烯影响植物的生长和发育。调控乙烯反应是由乙烯信号转导途径来完成的。乙烯反应元件结合蛋白(EREBPs)是乙烯信号转导途径中的下游传递元件,在植物中通过调控相关基因的转录和表达来调控乙烯反应。LeERF1和LeERF2基因属于EREBPs家族成员,含有典型的ERF结构域。为了进一步研究它们的调控机制,本论文做了以下几方面工作: (1) 克隆和鉴定LeERF1和LeERF2基因:通过RT-PCR方法从破色期番茄果实中克隆LeERFl和LeERF2基因,PCR产物被亚克隆到原核表达载体pET-30a上,在大肠杆菌BL21中筛选到含有目的基因的重组质粒pET-LeERF1和pET-LeERF2。 (2) 表达和纯化LeERF1和LeERF2蛋白:在大肠杆菌BL21中分别表达外源蛋白LeERF1和LeERF2,采用诱导温度为37℃,诱导剂IPTG浓度为lmmol/L,诱导时间为3h。LeERF1和LeERF2表达蛋白在细菌沉淀中约占菌体总蛋白53%和58%。应用Ni-NTA亲和层纯化回收LeERF1和LeERF2表达蛋白纯度分别为96%和99%。凝胶阻滞实验表明,LeERF1和LeERF2表达蛋白均具有与GCC盒结合特性。 (3) 制备抗LeERF1和LeERF2多克隆抗体:免疫兔子制备抗LeERF1多克隆抗体和抗LeERF2多克隆抗体效价均大于10000,经过DEAE-52离子交换柱纯化它们纯度分别达到了98%和99%。Western blotting检测表明,抗LeERF1多克隆抗体和抗LeERF2的多克隆抗体均具有免疫特异性。 (4) LeERF1亚细胞定位:通过胶体金免疫电镜定位的方法分析番茄果皮维管组织中LeERF1的亚细胞分布状况。研究表明,LeERF1蛋白主要分布在细胞核(N)、细胞核仁(Nu)和质体(P)等部位,而在细胞壁(Cw)和液泡(V)上几乎没有分布;破色期番茄果实中,LeERF1蛋白在细胞核(N)、细胞核仁(Nu)和质体(P)中含量明显比绿熟期番茄果实增多。Western blotting表明,破色期番茄果实中LeERF1蛋白含量比绿熟期番茄果实中LeERF1蛋白含量有明显增加。试验结果表明,LeERF1与番茄果实成熟相关。 (5) LeERF1结合启动子的分离和功能鉴定:通过LeERF1蛋白-DNA体外结合实验,克隆了长度分别为893bp和734bp的TLBP1和TLBP2两个基因片断,它们都含有AGCCGCC(GCC盒),其中厂LBP1含有典型IATA box和CAAT box。GenBank比对结果表明,TLBP1和TLBP2基因片段与编码番茄几丁质酶AY343058/AY343059/AY343060的启动子基因在核甘酸水平上同源性达到80%以上。 (6) LeERF1蛋白和番茄果实病程胁迫的关系:采用番茄青霉菌(Penicillium expansum Link)侵染绿熟期、破色期、粉红期和红熟期丽春番茄果实。研究表明,LeERF1随乙烯释放量的变化而变化,在蛋白水平受乙烯调控;LeERF1蛋白与编码几丁质酶LECHI17基因mRNA水平变化趋势基本一致;LECHI17基因mRNA水平与几丁质酶酶活具有相关性。试验表明,LeERF1可能在蛋白水平通过调控LECHI17基因的转录和翻译参与番茄果实的病程胁迫反应。