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甘薯茎线虫病抗性的分子标记及相关基因片段的克隆

柳哲胜  
【摘要】:本研究以高抗甘薯茎线虫病品种徐78-1和高感茎线虫病品种徐薯18的杂交F_1代分离群体为材料,对甘薯抗茎线虫基因进行分子标记研究。通过遗传分析推测甘薯茎线虫病抗性受单基因控制。采用BSA(bulk segregant analysis)法和SRAP(sequence-related amplification polymorphism)技术对甘薯抗茎线虫病基因进行分子标记研究,用抗感基因池共筛选了200对SRAP引物,得到能在抗感基因池之间扩增出多态性带的引物组合77对。选取其中的62对引物用分离群体进行鉴定,共获得4个与抗病基因连锁的分子标记,其中引物组合A_9B_4找到3个标记,分别命名为Nsp1、Nsp2和Nsp3,与抗茎线虫基因的遗传距离分别为4.71cM、4.71cM和6.32cM;引物组合A_3B_6找到了1个标记,命名为Nsp4,与抗茎线虫基因的遗传距离为8.73cM。 甘薯新品系农大603是从感茎线虫病品种徐薯18的辐照后代中获得的一个抗茎线虫病的突变体。根据已报道的植物线虫抗性基因的核苷酸结合位点(NBS)保守氨基酸序列设计兼并引物,用RGAP(resistance gene analog polymorphisms)技术及自行改进的SSAP(modified sequence-specific amplification polymorphisms)方法,对农大603和徐薯18的基因组进行PCR扩增,从农大603中扩增出含有植物抗病基因NBS保守序列的差异片段4个(片段58、片段54、片段72和片段77)。在Genbank上序列搜索和比对发现,克隆序列与已报道的植物抗病基因之间同源性较低。根据克隆片段的DNA序列设计引物,以抗、感茎线虫病的甘薯品种的基因组DNA为模板进行PCR扩增,结果显示由片段58、片段72和片段77设计的引物在抗、感品种上没有扩增出多态性带;由片段54设计的引物在抗病品种和感病品种之间扩增出多态性带,认为片段54可能是与甘薯抗茎线虫病有关的RGA。 根据片段54的序列设计特异引物P_(54),同时根据其它植物线虫抗性基因的NBS保守氨基酸序列设计1个兼并引物P_2,对农大603和徐薯18的块根mRNA进行RT-PCR扩增,获得一个大小483bp基因片段,该基因在农大603上的表达量明显高于徐薯18。同源性比较发现,该基因片段与其它植物肌醇-1-磷酸合成酶(Myo inositol-1-phosphate synthase,MIPS)基因有较高的同源性。采用3’RACE技术扩增出目的基因的3’末端cDNA。根据植物MIPS基因5’端保守的氨基酸序列设计兼并引物,并与3’端的特异引物组合,扩增出该基因的5’端cDNA序列。所克隆的基因的cDNA全长为1856bp。同源性比较表明,目的基因与其它植物MIPS基因的同源性较高,如与大豆、番茄的MIPS基因DNA序列同源性分别为83.63%和83.89%;氨基酸序列同源性分别为92.16%和90.59%,因此认为所克隆的基因是甘薯MIPS基因,并推测该基因可能与甘薯抗茎线虫病有关。甘薯肌醇-1-磷酸合成酶基因全长cDNA的克隆,有利于进一步研究该基因与甘薯对茎线虫病抗性的关系。


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