钙依赖蛋白激酶和腺苷酸环化酶参与拟南芥响应大丽轮枝菌毒素诱导信号转导过程的实验证据

【摘要】：钙是植物应答多种生物和非生物逆境胁迫的重要信使。胞质自由钙的变化通过对下游钙调节蛋白的活性调控而进行信息传递并最终调节相关的生理生化过程,这是植物适应逆境和环境变化的主要机制之一。CDPK作为植物特有的一类钙受体蛋白激酶参与并调控了许多逆境反应和生理过程。有研究表明CDPK也参与了植物响应病原微生物或激发子诱导的信号转导途径,但其具体功能尚不明确。 黄萎病危害包括棉花在内的多种重要经济作物,目前研究认为其致病菌大丽轮枝菌分泌的毒素具有使植物萎蔫的作用,但对植物应答毒素的信号转导机理并不清楚。本研究首先观察到黄萎菌毒素对拟南芥种子萌发和幼苗生长均有明显的抑制作用,另外用针刺接种方法处理拟南芥叶片能产生典型的过敏性坏死病斑,说明毒素具有外源激发子的作用。在5种浓度的毒素筛选梯度培养基上对CDPK-CRK基因家族26个T-DNA插入纯合突变体株系进行了筛选,发现CPK18的两个不同突变体株系(cpk18A和cpk18B)与野生型有明显差异,表现为对毒素处理更为敏感。对CPK18恢复突变和过表达植株的表型分析表明,恢复突变转基因植株对毒素的敏感性与野生型相同,而CPK18的过量表达使植株提高了对毒素的耐受性。另外,当培养基中不存在外加CaCl_2时,T-DNA插入突变体、过量表达和野生型植株幼苗对毒素的敏感程度没有区别。均表现为毒素诱导的快速白化死亡;而当培养基中加入5mmol/L CaCl_2时能观察到明显的性状差异。这些结果表明拟南芥CPK18可能作为钙信使的下游蛋白参与了植物响应毒素诱导的信号转导过程。对防卫反应标记基因PR1的Northern检测表明,毒素处理后CPK18 T-DNA插入突变体中PR1基因的转录在时间上迟于野生型,而过表达植株中PR1基因的转录则早于野生型,并且过表达植株中PR1转录量也显著高于野生型。这说明CPK18的编码产物可能调控PR的转录过程。 cAMP作为第二信使参与了植物对病原诱导子的超敏反应。本实验室前期工作利用拟南芥和黄萎病菌毒素研究模型证明了cAMP信使通过调控下游SA信号而进一步传递毒素诱导的信息。为深入研究cAMP的调控作用,本研究首先对拟南芥中编码腺苷环化酶(AC)基因AC189和AC388的T-DNA插入纯合突变体的表型进行了观测。结果表明,在毒素处理条件下,AC189和AC388的突变体均对毒素较野生型更为敏感,突变体幼苗在正常生长状况下内源cAMP含量也明显低于野生型。据此推测突变体对毒素敏感的表型可能是由于AC189和AC388被敲除、内源cAMP合成受阻而造成的。自野生型拟南芥克隆了AC189的cDNA全长,构建过表达载体转化拟南芥,转化植株T_2代在毒素针刺处理下表现出较小病斑,说明AC189的过量表达使植株对毒素的敏感程度降低。以上实验证据表明,AC189和AC388可能通过调控拟南芥体内cAMP的水平而参与调控真菌毒素诱导的信号传递过程。