小尾寒羊骨骼肌细胞Myostatin基因打靶的研究

【摘要】：基因打靶是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组,并整合在预定位点,而改变细胞遗传特性的方法。本研究探讨了在小尾寒羊骨骼肌细胞中进行myostatin基因的打靶,设计了两个无启动子打靶载体MSTN-GFP和MSTN-Neo,并转染原代胎儿和新生羊骨骼肌细胞,通过观察细胞的发光情况和药物筛选分离阳性细胞,利用PCR和Southern杂交方法验证阳性细胞克隆,结果显示总打靶效率为6×10~(-5)。 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)又称GDF-8(growth differentiation factor 8),是肌肉生氏的负调控因子,是TGF-β(transforming growing factor)超家族的成员之一,Myostatin的主要功能是抑制肌肉的过度增生。中国小尾寒羊产子率和产肉率不能同步的缺点使我们想到利用基因打靶的方法下调myostatin基因活性而生产出同时具有产子率高和肌肉产量也高的绵羊品种。 利用Long-PCR的方法,从牛的基因组中成功得获得5.0kb和1.0kb的二段扩增产物。其中5.0kb片段位于MSTN基因的第一至第三外显子的前段,1.0kb片段位于MSTN基因的第三外显子后段和3’非翻译区部分片段。两个片段分别克隆于pMD-18T载体。测序结果表明克隆的两个片段均为绵羊MSTN基因的序列。两个片段中的部分4.6kb和0.8kb分别作为打靶载体的5’和3’同源臂,以载体pGEM-3Zf(-)为骨架,分别以Neo和GFP为标记基因,构建了无启动子打靶载体MSTN-Neo、MSTN-GFP,脂质体转染小尾寒羊骨骼肌细胞以敲除羊的MSTN基因。 取妊娠50天的小尾寒羊胎儿及新生1周的羊后腿伸肌,用胰蛋白酶消化法分离出骨骼肌细胞,经体外培养,传代,建立了骨骼肌细胞系。以建好的无启动子打靶载体为外源基因,AatⅡ线性化后采用脂质体转染骨骼肌细胞。 载体MSTN-GFP转染新生羊骨骼肌细胞后24小时观察细胞发光情况,平均每10~5受体细胞中有2～3个发出绿色荧光。 打靶载体MSTN-Neo,用脂质体转染小尾寒羊胎儿和新生羊骨骼肌细胞,分盘后48小时加入G418进行筛选6～10天,筛选过程中,在相同条件下在培养液中分别加入15%FCS和10%FCS进行比较研究,分离抗G418的单细胞克隆,共得到细胞克隆88个,分别扩大培养,部分冻存,部分提取基因组进行PCR检测和Southern杂交分析,结果分析表明确定1个细胞克隆的MSTN基因的一个等位基因被敲除。 本文研究了小尾寒绵羊MSTN基因片段的克隆、无启动子打靶载体的构建、小尾寒羊骨骼肌细胞的分离和体外培养以及打靶阳性细胞的制备和确证。利用打靶阳性细胞进行核移植的工作将进一步开展。