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拟南芥内质网上的Profilin2蛋白结合蛋白的分离与纯化

王凤  
【摘要】:真核细胞内的微丝骨架在其它信号调控下呈现高度的动态变化,以适应变化的环境。Profilin是调节微丝骨架动态变化的重要成员之一。拟南芥中有5种Profilin异型体,它们分别在植株的不同发育阶段及不同器官、组织中进行特异的表达,这些不同的Profilin异型体可能分别执行不同的功能。Profilin在细胞内的定位已有很多人进行了研究,大多数实验结果表明Profilin在细胞质和细胞核内均匀分布,而我们前期的实验结果表明Profilin 1和Profilin 2在细胞质内的分布存在明显的差异。Profilin 1呈纤维状网络结构分布,而Profilin 2呈类似内质网的网格状结构分布,因此我们推测Profilin 2可能与内质网共定位,而Profilin 1与微丝共定位。这种分布上的显著差异说明这两种异型体在细胞内执行着各自不同的生理功能。我们进一步推测Profilin 2可能特异地和内质网上的某类蛋白质相互作用,导致了Profilin 2与Profilin 1在细胞质内的不同形式的分布。 本论文研究根据前期研究达到的结果,试图从内质网上分离和鉴定与Profilin 2特异结合的蛋白质,为说明Profilin 2在细胞中的特异分布提供科学依据,并进一步为说明Profilin异型体的功能特异性提供实验证据。 为了从内质网分离蛋白,我们选用拟南芥悬浮细胞为实验材料,它的优点是繁殖速度快,培养方便,可以在较短时间内大量获得实验材料。利用密度梯度离心方法分离出纯化的粗面内质网,经过对传统实验方法的改进,将原来200分钟的离心时间缩短到了70分钟,从而保证了内质网膜上的膜蛋白具有更好的生物活性,并且通过改变蔗糖密度梯度离心时各层蔗糖溶液的体积比例,使粗面内质网的产率有了明显的增加。通过电镜观察,证明获得了较高纯度的粗面内质网。利用纯化的内质网膜与原核表达、纯化的Profilin 2包被的胶体金颗粒的结合实验,证明了Pofilin2是与粗面内质网上膜蛋白的相互作用而结合在内质网上的。为了分离与Pofilin 2特异结合的膜蛋白,利用原核表达、纯化的Profilin 1和Profilin 2结合在Ni-NTA的琼脂糖上,再结合Pull-down技术,将分离出的蛋白质进行SDS-PAGE电泳,用改进的银染方法进行电泳结果显色,显示出有4条比较明显地与Profilin 2特异结合的内质网上的膜蛋白。选择了其中一条含量最高的特异结合Profilin 2的蛋白条带(28 kDa未知蛋白)进行切胶回收,使用LC-MS/MS液相层析串联式质谱仪进行蛋白质的特性分析。根据质谱仪检测到的所有肽段与拟南芥中已知蛋白质的质谱数据库进行匹对,结果显示,质谱仪检测到的分值最高的肽段:拟南芥Profilin 1的N末端第56个氨基酸到第75个氨基酸中的19个氨基酸序列---DFEEPGFLAP7GLFLGGEK,其在拟南芥Profilin 1蛋白的二级结构为无规则盘旋-折叠-折叠,此序列可能参与Profilin与Actin的相互作用,从而推测内质网上分离出来的28 kDa未知蛋白也具有与Actin结合的功能。


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