合欢、金合欢和银合欢根瘤菌多相分类与系统发育研究

【摘要】：本论文采用数值分类、16S rDNA PCR RFLP、SDS-PAGE全细胞蛋白电泳、rep-PCR指纹图谱分析、系统发育分析(16S rRNA、atpD和ginⅡ三个基因部分序列分析)、G+C mol%测定及DNA-DNA同源性分析等技术对74株分离自我国亚热带地区的合欢、金合欢和银合欢根瘤菌进行了多相分类与系统发育研究,以了解我国合欢、金合欢和银合欢根瘤菌多样性,发现并保存新的、优良的根瘤菌种质资源。 生理、生化性状测定表明,部分菌株对一些抗生素的抗性可以达到300 μg/ml;2株菌可以抗5%的NaCl:分别有2和22株菌可以在pH4.0和pH12.0的YMA平板上生长,大多数菌株在37℃下生长良好,23株菌可以抗60℃、10min的热冲击。 采用数值分类、16S rDNA PCR RFLP和SDS-PAGE全细胞蛋白电泳对待测菌株进行初步分群,结果表明各方法之间具有很好的一致性。数值分类聚类结果在84%～87.5%的相似性水平上将供试菌株分为8个群,群1、群4、群6和群7分别与A.tumefaciens、M.plurifarium、B.japonicum和B.elkanii的参比菌株聚在一起,其它四个群未包括已知参比菌株;16S rDNA PCR RFLP分析中待测菌株共产生16种酶切图谱类型,除3株菌分散外,其它菌株位于Rhizobium、Agrobacterium、Sinorhizobium、Mesorhizobium和Bradyrhizobium。SDS-PAGE全细胞蛋白电泳将供试菌株分为11个群。在后两种方法中数值分类群5和群8的菌株分别与M.plurifarium和B.yuanmingense的参比菌株聚群,数值分类群2和群3的菌株未与已知参比菌株聚群。 rep-PCR指纹图谱分析将供试菌株分成28个遗传群,表明供试菌株存在着较大的遗传多样性。rep-PCR分辩率更高,适合种以下水平的遗传多样性研究。 16s rRNA基因全序列分析确定了供试代表菌株的系统发育地位,CCBAU61139、CCBAU25213、CCBAU25010、CCBAU43060和CCBAU45226位于Rhizobium-Agrobacterium系统发育分支;CCBAU35204位于Sinorhizobium系统发育分支;CCBAU51276、CCBAU51471及CCBAU61158位于Mesorhizobium系统发育分支;CCBAU35234、CCBAU61178和CCBAU35085位于Bradyrhizobium系统发育分支。该结果与数值分类、16S rDNA PCR-RFLP和SDS-PAGE全细胞蛋白电泳结果一致,并经atpD和ginⅡ基因部分序列分析得以进一步证实。 DNA-DNA杂交结果表明,数值分类群1和群2的菌株分别为A.tumefaciens和A.vitis,数值分类群3的代表菌株CCBAU61158与所处系统发育分支Mesorhizobium已知种参比菌株的DNA同源性均低于34.1%,为一个新种群Mesorhizobium sp.(Albizia)。多相分类各方法表明数值分类群4、群5及菌株CCBAU35094和CCBAU35103应归为M.plurifarium,但这些菌株之间的DNA同源性为21.4%～85.2%,证实了M.plurifarium基因组存在极大多样性的报道(de Laiudie et ak.1994,1998;Wang et al.2003)。 综合以上结果得出如下结论:供试合欢根瘤菌存在较大的表型和遗传多样性,31株合欢根瘤菌分属于Mesorhizobium、Rhizobium和Bradyrhizobium三属8种,并发现一个新种群Mesorhizobiumsp.(Albizia);金合欢和银合欢对微共生体的选择具有共性,也有一定的偏好性,13株分离白银合欢的根瘤菌主要归于M.plurifarium和Sinorhizobium属,只有一株为慢生根瘤菌,归为B.elkanii,16株金合欢根瘤菌中有12株为慢生根瘤菌,分属于B.elkanii和B.yuanmingense两个种,其它为M.plurifarium。