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玉米种子特异性表达基因Zpu1和brittle2启动子的分离与功能分析

陈小平  
【摘要】:基因工程在很大程度上是将目的基因以一定的表达量在特定的组织中表达,因而需要一些调控外源基因有效表达的分子元件,其中启动子是最重要的一个。随着基因工程的不断发展,为了满足基因工程对不同功能启动子的需要,就必须分离一些新型有效的启动子,对它们的结构特点、活性强弱以及时空表达特异性进行深入的研究。玉米作为世界上最大的粮食和饲料作物,其基因工程的研究不仅具有重要的理论意义,而且具有巨大的应用前景。玉米种子中富含淀粉,但是有关淀粉合成途径中一些重要基因的调控序列的结构和功能的研究相对比较少。因此,分离淀粉合成途径中的重要基因的启动子并研究其表达特性,对于将玉米种子作为生物反应器并在其中表达并储藏有价值的蛋白是很有意义的。 本试验根据GenBank中Zpul cDNA的序列(Accession no. AF080567)设计一对引物,通过RT-PCR方法从授粉后28天的玉米种子的总RNA中扩增出一条674bp的片段。该片段位于ZpulcDNA的5’端,用它作为探针筛选玉米lambda噬菌体基因组文库。经过四轮的筛选得到了10个纯化的阳性克隆,对阳性克隆进行酶切分析,最后选择用EcoRI单酶切的一条约3.5kb的目的片段进行亚克隆。将亚克隆片段构建到测序载体上测序,结果表明该片段全长3601bp,其中有2267bp为zpul基因的5’侧翼序列,1334bp为Zpul基因编码区序列,在1334bp的基因编码区序列中包含了四个外显子和三个内含子。对2267bp的5’侧翼序列进行5’端和3’端的缺失,得到5条不同长度的片段:分离到的全长片段Z1(2267bp, -2267~-1);三条5’端缺失片段分别为Z2(1943bp,-1943~-1),Z3(1153bp,-1153~-1)和Z4(516bp,-516~-1);一条3’端缺失片段为Z5(1754bp,-2267~-513)。将这5个片段插入到真核表达载体pBI121中替换35S启动子,从而得到了5个植物表达载体:pZ1,pZ2,pZ3,pZ4和pZ5。通过农杆菌介导的方法将这些载体转化烟草,对烟草再生植株进行PCR检测,五个载体分别得到了不同数目的PCR阳性转基因植株。在转基因烟草植株不同的生长发育时期对不同的组织和器官进行GUS组织化学染色和荧光定量检测。结果表明:(1) 五个缺失载体的转基因植株在幼苗时期的根、茎、叶和开花后两天的柱头和子房等组织中均没有GUS活性,说明这五个片段在这些组织中都没有启动活性;(2) Zpul启动子的近端516bp的片段Z4能驱动GUS报告基因在种子中表达,并且表达模式与分离的全长(2267bp)片段Z1很相似,只是Z4的表达量比Z1低很多;(3) 当缺失zpul启动子远端的324bp的区域时,启动子的表达模式发生了很大的变化,由种子特异性表达变为组成型表达,此区域可能存在一个正调控元件,可以提高启动子在玉米种子中的表达;(4) 在-1153至-516区域发现了一个负调控元件,可以抑制启动子在各个组织和器官中的表达;(5) 比较5’端缺失的Z4片段和3’端缺失的Z5片段的表达活性,表明Zpul基因5’侧翼序列中临近起始密码子ATG的约0.5kb的近端序列是启动子活性所必需的。 另外,本试验还克隆了淀粉合成途径中关键调控酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的小亚基brittle2基因5’侧翼0.9kb的序列。将该片段构建到pBI121载体并转化烟草,GUS活性分析表明该片段具有启动子活性并包含了种子特异性表达所需的调控元件。为研究该片段表达活性的强弱,我们


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