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甘露寡糖诱导抗病反应初步研究及枯草芽孢杆菌甘露聚糖酶基因的克隆与表达

张清霞  
【摘要】:甘露寡糖是由2-10个葡萄糖、甘露糖分子构成的甘露低聚糖。本研究利用甜瓜-白粉病病害体系检测甘露寡糖的诱导抗病作用。结果证实甘露寡糖能降低白粉病的发生。经甘露寡糖处理后的甜瓜叶片中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、多酚氧化酶、过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性均有不同程度的增强。其中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶分别在第13d和16d达到最高峰,以后酶的活性逐渐下降至对照水平:而苯丙氨酸解氨酶的活性一直处于上升趋势,后期(5-6 d)最为明显;同时寡糖也明显激发了多酚氧化酶和过氧化物酶活性。 β-甘露聚糖酶(EC3. 2. 1. 78)是一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖的水解内切酶,可以将植物胶水解成由2-10个单糖分子构成的甘露低聚糖。本研究从不同地区的土样中分离到高产β-甘露聚糖酶的一株细菌Z-2,通过16SrDNA序列同源性分析及生理生化性状测定将菌株Z-2鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对粗酶性质的初步研究证明其酶稳定pH范围较宽(pH5.0-pH8.0),最适pH为6.0;在40-55℃酶活力保持稳定,最适温度为50℃,高于55℃酶活力迅速下降。酶解产物经薄层层析证明为低聚糖,不含单糖。 通过粘粒pLARF-5构建菌株Z-2的基因组文库,通过PCR介导的筛选方法,从Z-2基因组文库中获得甘露聚糖酶基冈man。以pET22b(+)为载体,构建pET-Ncol3(pelB信号肽)和pET-NdeI18(野生型信号肽)两种表达载体,E coli BL21(DE3)为宿主菌,经IPTG诱导,两种载体都成功的表达了man基冈。pET-NcoI3的Man胞外活性是pET-NdeI18的2倍。为了增加胞外酶的产量,本文对培养基、培养温度、IPTG的诱导浓度、菌体的浓度4个因素进行了优化,结果表明当采用TB培养基,37℃振荡培养,当菌体浓度达剑OD600=0.75时,加入IPTG诱导4h(终浓度为0.01 mM),培养基中甘露聚糖酶的活力可达到55.33U/mL,显著高于野生菌产生酶的活力(41.82U/mL)。 由丁野生型man基因在Pseudomonas fluorescens 2P24中不表达或表达量较低,通过遗传改造野生man基因的起始密码子(TTG→ATG),核糖体结合位点(GGGGAG→AAGGAG)和信号肽(野生型→pelB信号肽),构建出3个表达结构,分别连接在穿梭载体pRK415上转化Pseudomonas fluorescens 2P24。活性测定结果表明,培养基中不加魔芋粉时Man诱导活性很低,加入后胞内和胞外均诱导目的蛋白的积累,改造后的质粒胞外活性为1.55 U/mL,胞内约为3.8U/mg。苗期生测结果表明,转入man基因2P24菌株对烟草花叶病有一定的防病效果。


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