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拟除虫菊酯酶联免疫分析方法研究

张婧  
【摘要】:拟除虫菊酯(Pyrethroid)作为一类广谱性杀虫剂,广泛应用于农业生产,在作物体及其农副产品中的残留水平较高,危及到了人类健康。本研究在建立优化溴氰菊酯间接竞争ELISA检测方法的基础上,研制出溴氰菊酯残留检测ELISA试剂盒,并在拟除虫菊酯多残留ELISA检测方法建立方面进行了一些初探。 试验建立优化了溴氰菊酯残留间接竞争ELISA检测方法,确定了抗原抗体最适工作浓度为112800,包被方式为37℃3 h或37℃3 h后4℃过夜,显色时间为15 min,反应环境为含10%甲醇、pH 7.4、0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液。在对以上反应条件进行综合测试的基础上,建立溴氰菊酯标准抑制曲线,得回归方程y=0.18x-0.1483, R2=0.9848, IC50=4.00μg·mL-1,线性范围为0.02~100μg·mL-1。 研制出溴氰菊酯ELISA快速检测试剂盒,并以苹果为试样,对试剂盒的技术参数进行测定。试剂盒的灵敏度IC50为4.00~7.71μg·mL-1,空白苹果检出限为0.01~0.02 mg·kg-1;以0.1 mg·kg-10.5 mg·kg-1和1.0 mg·kg-1三个水平添加苹果,回收率为86.2-105.8%,变异系数为6.0~9.8%;试剂盒中抗体对其他菊酯类农药(如:氯菊酯、高效氯氟氰菊酯、甲氰菊酯等)交叉反应较小;试验证明试剂盒可在2~8℃保存6个月。 针对部分拟除虫菊酯的共有结构,以4’-羟甲基苯甲酸、2,2-二甲基环丙烷甲酸为原料,设计合成一种半抗原Hapten,将Hapten分别与BSA、OVA偶联制备人工抗原Hapten-BSA和Hapten-OVA,偶联物经紫外光谱扫描鉴定。以Hapten-BSA为免疫原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,抗体效价为51200。以Hapten-OVA为包被原建立间接竞争ELISA检测方法,确定抗原最适工作浓度为1:6400,抗体最适工作浓度为1:12800,反应环境为含10%甲醇、pH 7.4、0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液。 在上述反应条件下,将得到的抗体对多种物质进行特异性测试,探明拟除虫菊酯的免疫决定区。拟除虫菊酯通用半抗原设计必须要囊括苯环和三碳环两个重要作用位点,而氰根离子、卤素以及与载体蛋白连接部位碳链的引入,可以提高检测的灵敏度,使拟除虫菊酯多残留ELISA检测方法在实际生产中的应用成为可能。


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