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油菜BnGOLS1基因功能鉴定及酶学性质的研究

景寅  
【摘要】:正常性种子在成熟发育阶段会经历一个脱水过程,为减轻脱水所造成的组织损伤,种子在这一时期形成了脱水耐性。种子脱水耐性的形成与种子内棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides, RFO)的积累呈正相关。肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase, GOLS)则是RFO合成过程中的关键酶,但具体的调控机制尚未得到阐明。 本研究通过脱水耐性实验测定了拟南芥(Col)的种子脱水耐性获得的时间,同时对种子进行人工脱水的方法进行了改进,使之达到了测定要求。对甘蓝型油菜BnGOLSl基因进行的原核表达结果表明,IPTG诱导后的表达产物具有肌醇半乳糖苷合成酶活性,经镍柱纯化后测定其酶学性质,发现BnGOLS1的最适温度为39℃,最适pH为8.0,且在较宽的范围内(35~55℃)有较高的酶活性,对肌醇和UDP-Gal的Km值分别为4.98mM和0.401mM,可被Mn2+激活,且最适浓度为8mM。分别以甘蓝型油菜(Brassica napus. L)和拟南芥(Arabidopsis thaliana. L)为材料,利用前期构建的BnGOLS1基因的过表达、带有种子内特异启动子的GS载体及连有GUS报告基因的启动子分析载体,经农杆菌介导转化及抗性筛选后,对所获得的阳性株进行PCR检测和southern杂交鉴定,并对所获得的转基因植株进行生理生化及表型研究。实验结果显示与野生型拟南芥相比,过表达BnGOLS1基因的拟南芥中GOLS酶活确有明显增加,经液相色谱检测发现RFO含量也有提高,并能耐受一定的高温处理和干旱胁迫,但对外界的高盐胁迫其抗性不明显,表明BnGOLS1基因在一定程度上可提高植物耐受高温和干旱胁迫的能力。


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