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几种野生百合离体保存技术的研究

傅伊倩  
【摘要】:我国百合属植物种质资源丰富,是百合的自然分布中心。一直以来,百合种质资源保存的方式主要是田间种植,但田间种植保存存在较大风险。因此,发展多层次、多种保存技术对百合种质资源保存具有重要意义。 本文以卷丹、大花卷丹、山丹、宝兴百合、有斑百合等5种野生百合为对象,分别研究了其快速繁殖、常规继代离体保存、限制生长离体保存及超低温保存技术。结果如下: (1)建立了以百合鳞茎、珠芽、叶片为外植体,直接诱导形成鳞茎的快繁途径。 诱导培养基配方为:卷丹鳞茎(薄片):MS+NAA1.0mg·L-1+TDZ0.2mg·L-1;卷丹珠芽:MS+NAA1.0mg·L-1+TDZ0.1mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;大花卷丹鳞茎:MS+NAA0.2mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1;山丹鳞茎:MS+NAA2.0mg·L-1+TDZ0.2mg·L-1;宝兴百合叶片:MS+NAA2.0mg·L-1+TDZ0.2mg·L-1;有斑百合鳞茎(薄片):MS+NAA1.0mg·L-1+TDZ0.2mg·L-1。外植体上直接形成鳞茎后,将其接种至生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg·L-1+AC2g·L-1),诱导生根后,移栽可正常生长。 (2)建立了5种野生百合常规继代离体保存的方法。 诱导外植体直接形成鳞茎后,在常温23±2℃、光照强度约为40μmol·m-2·s-1、光照时间14h·d-1的条件下,将其接种至常规继代离体保存培养基(1/2MS+NAA0.5mg·L-1+AC2g·L-1)中。每1个月左右,瓶内根系长满后,可切除根系继续继代培养。此方法可实现离体保存。 (3)建立了大花卷丹限制生长离体保存的方法。 诱导大花卷丹鳞片直接形成鳞茎,其直径约1~2cm时,接种至MS+蔗糖90g·L-1+甘露醇30g·L-1培养基中保存,可其控制生长,保存至少6个月,无需继代。处于限制生长离体保存的大花卷丹鳞茎,转移至生根培养基中,能正常生长;取其鳞片能在诱导培养基中正常分化。因此,大花卷丹可通过添加蔗糖及甘露醇抑制生长从而实现其中期离体保存。 (4)建立了卷丹玻璃化超低温保存技术程序。 诱导卷丹珠芽鳞片直接形成鳞茎,其直径约1~2cm时,仅留贴近茎尖的几层鳞片,放入0.3M高糖培养基中,在4℃冷锻炼1周。显微镜下剥取茎尖,常温下Loading溶液处理20min,0℃下PVS2溶液处理100min;LN2迅速冷冻保存,37℃水浴化冻后,常温下用Unloading溶液处理2次,每次10min。在MS基本培养基中可恢复生长。通过继代、壮苗、生根培养,并在4℃低温冷藏处理8周后,移栽至基质中可正常生长。 对比了常规玻璃化、包埋玻璃化及滴冻玻璃化三种方法对卷丹茎尖超低温保存效果研究,结果表明,常规玻璃化法和滴冻玻璃化法,液氮保存后的茎尖存活率较高,再生情况正常,适宜卷丹茎尖超低温保存。 本文建立了5种野生百合直接诱导外植体形成鳞茎的快繁途径及常规继代离体保存的方法,建立了大花卷丹限制生长离体保存的方法和卷丹玻璃化超低温保存技术程序,可为我国野生百合种质资源安全、有效保存提供相应的技术指导。


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