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黑曲霉发酵法制备山杏多肽及其生物活性的研究

王文江  
【摘要】:研究发现自由基影响着众多疾病的发生,其中就包括癌症及一些心血管疾病,为了应对这一趋势,科研领域逐渐重视消除自由基影响的研究。活性多肽具有各种生物功能,对于治疗癌症及心血管相关病症都有一定疗效。研究发现经过酶解得到的山杏多肽不仅利于机体消化吸收,而且具备多种生物活性,对于清除自由基及一些癌症的治疗都具备一定的作用。山杏中富含优良的蛋白质资源,经过酶解后可以获得大量的山杏生物活性多肽,深入研究开发出山杏多肽潜在的生物学活性,将具有极大研究前景以及巨大的经济、社会效益。 本文以山杏粕为原料,利用黑曲霉发酵法制备山杏多肽,并对其制备工艺进行响应面优化。利用超滤、凝胶层析等手段,对得到的山杏多肽进行分离纯化。之后对得到的不同组分的山杏多肤进行了抗氧化及抗肿瘤活性的初步研究,并以此为基础,对活性山杏多肽进行进一步分离纯化。 在单因素试验的基础上,采用四因素三水平的响应面法对影响山杏多肽含量的4个主要因素,即液料比、初始pH、接种量和发酵温度进行分析优化。结果表明山杏多肽发酵法制备工艺的最佳条件为:发酵时间60h、体系初始pH为6.5、发酵温度30℃、液料比12mL/g、接种量10.6%,在此条件下山杏多肽的实际含量为4.768mg/mL,与预测值进行对比后,发现相对误差在1.05%左右,说明该工艺优化可靠。通过实验优化,提高了发酵法制备山杏多肽的得率,可以作为山杏多肽制备的一种有效工艺。 利用超滤法,将山杏多肽分离为ASP1、ASP2、ASP3及ASP4四种多肽样品。然后分别考察了这四种样品对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除作用以及总还原力等指标。经过实验,发现这四种山杏多肽都具备一定的抗氧化活性但当检测指标和方法不同时,其抗氧化活性各有强弱。ASP4和ASP2样品对DPPH自由基清除能力较好,ASP2样品对羟自由基的清除作用效果更加突出,ASP2及ASP4样品对超氧阴离子自由基清除能力较强,ASP4及ASP2样品在总还原力实验中表现更好。综合考虑,得出ASP1、ASP2、ASP4三种多肽样品相对于ASP3的总体抗氧化效果更加明显。 取ASP1、ASP2及ASP4作为实验样品,经MTT实验表明,ASP4样品对于caco-2细胞增殖的抑制作用较好,IC5o值为1.755mg/mL。取酶解法制备的三种山杏多肽SSP1、SSP2及SSP4作为对照,考察其与发酵法制备的山杏多肽样品在抑制肿瘤增殖效果方面的优劣,经过MTT实验,得到SSP1、SSP2及SSP4多肽样品的IC50值分别为2.495mg/mL、3.595mg/mL及2.963mg/mL,根据实验结果综合考虑,依旧是ASP4样品对于肿瘤细胞增殖的抑制效果更佳。 取ASP4山杏多肽作为实验样品,考察其对MCF7肿瘤细胞增殖的抑制效果以及对于正常细胞大鼠小肠隐窝上皮细胞(IEC-6)增殖的影响。经过MTT实验,结果发现ASP4样品对于MCF7细胞的增殖有一定的抑制作用,而对于正常细胞IEC-6细胞增殖的影响并不显著。将ASP4多肽样品经Sephedax G-25凝胶层析柱进行分离纯化,得到三组样品:AASP4、BASP4及CASP4。依旧利用caco-2细胞作为实验细胞株,采用MTT实验考查这三组样品对于肿瘤细胞增殖的抑制作用,实验发现AASP4样品的效果更佳,IC50值为2.297mg/mL,而CASP4样品与BASP4样品的抑制率较低。


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