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两种非泌盐红树离子平衡调控机理与耐盐性研究

鲁彦君  
【摘要】:土壤盐渍化是世界性的资源与环境问题,盐渍化和次生盐渍化会导致土地生产力下降、生态环境恶化,危及粮食安全及生态安全。研究植物耐盐机制,培育抗盐植物新品种是改善土壤盐渍化的途径之一。红树是生长在海岸潮间带、有别于典型陆生植物的木本盐生植物,是研究植物抗盐机制的又一种典型材料。揭示红树植物的耐盐机制,还能为我国滨海盐碱地区的生态环境建设提供理论指导和技术支撑。 植物维持K+/Na+平衡的能力在一定程度上决定着植物对盐生环境的适应性,盐胁迫信使在K+/Na+平衡调控过程中发挥重要作用。目前对胁迫信使调控红树离子平衡机制的研究较少且不系统,因此,本论文以非泌盐红树木榄(Bruguiera gymnorrhiza (L.) Savigny)与秋茄(Kandelia candel (L.) Druce)为试材,从组织水平离子的积累、根系离子动态转运以及胁迫信使(H2O2、NO、Ca2+)和质膜Na+/H+逆向转运体系对离子动态转运的调控来探索两种红树的耐盐机制,并克隆秋茄液泡膜水通道蛋白KcTIP1基因,通过在烟草中异源表达,初步验证该基因在植物渗透调节及耐盐性中的作用。主要结论如下: 1.以木榄与秋茄幼苗作为实验材料,研究其在不同生长环境及不同NaCl浓度处理下各器官离子浓度(Na+、Cl-、K+、Ca2+和Mg2+)的变化。结果显示,(1)尽管在自然生境积累的盐分与K+浓度高于温室生长的,但器官间的积累规律一致,且秋茄积累K+的能力高于木榄,这是我们用温室培养的幼苗作为实验材料的理论依据。(2)盐离子积累:短期盐胁迫处理(100mmol/L NaCl/24h)仅提高秋茄根系的Na+浓度。长期盐胁迫(400mmol/L NaCl/28d)处理提高两种红树对盐离子的积累,但树种间有差异:(A)秋茄根、茎、叶Na+浓度的增幅大于木榄,但木榄胚轴的Na+浓度增幅大于秋茄;(B)木榄根、茎Cl-浓度的增幅大于秋茄,但秋茄胚轴与叶的增幅大于木榄,说明木榄胚轴有储存Na+的作用,秋茄胚轴有储存Cl-的作用。(3)营养元素积累:长期盐胁迫降低两种红树根的营养水平(秋茄Mg2+除外),说明Na+可取代根中部分营养元素。(4)盐分与营养元素的平衡:短期盐胁迫下,秋茄维持K+/Na+平衡的能力强于木榄。长期盐胁迫下,木榄维持K+/Na+平衡的能力强于秋茄。 2.以木榄和秋茄幼嫩根尖作实验材料,通过扫描性离子选择电极技术(SIET)研究不同程度盐胁迫诱导的红树根尖Na+、H+、Cl-、K+的动态转运,结果显示,(1)短期盐胁迫(100mmol/L NaCl/24h)与长期盐胁迫(200mmol/LNaCl/7d)均促进木榄与秋茄Na+外排与H+内流,可被阿米洛利(Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂)与原钒酸钠(质膜H+-ATPase抑制剂)抑制,证明盐诱导的Na+外排与H+内流由根尖表皮细胞质膜H+-ATPase驱动Na+/H+逆向转运蛋白介导。(2)短期与长期盐胁迫处理均促进两种红树Cl-外排,Cl-的流速大于Na+,且木榄排Cl-能力强于秋茄,推测红树根系有限制Cl-向地上部分运输的作用,且体内可能存在Cl-源;(3)短期与长期盐胁迫处理均促进两种红树根尖K+外排,可被TEA(去极化激活的外向K+通道抑制剂)抑制,证明K+外排由去极化激活的外向整流型K+通道(KORCs)或非选择性阳离子通道(NSCCs)介导;此外,盐诱导木榄K+外排幅度小于秋茄,推测木榄H+-ATPase活性比秋茄强。(4)长期盐胁迫诱导木榄Na+外排幅度大于秋茄,K+外排幅度则小于秋茄,说明木榄根系调控K+/Na+平衡能力比秋茄强。(5) Mannitol (170mmol/L Mannitol/24h,与100mmol/L NaCl等渗)处理并未引起木榄Na+、H+、Cl-、K+流明显变化,却促进了秋茄Na+外排,证明木榄对盐胁迫的响应具有高度离子特异性,而秋茄则对盐胁迫的渗透效应也有响应。 3.以木榄与秋茄幼嫩根尖作为实验材料,研究胁迫信使(H2O2、Ca2+、NO)以及质膜Na+/H+逆向转运体系对短期盐胁迫下红树根系K+/Na+平衡的影响。结果显示,(1)(A)外源H2O2与Ca2+促进盐诱导的木榄Na+外排,抑制盐诱导的K+外排;NADPH氧化酶抑制剂DPI、ROS清除剂DMTU以及过氧化氢酶(CAT)均可抑制盐诱导的Na+外排,促进盐诱导的K+外排,初步说明盐诱导的H2O2与Ca2+信号对木榄根系K+/Na+平衡有正向调控作用。(B)盐胁迫诱导木榄H2O2外流,可被DPI、DMTU、 Amiloride以及Vanadate抑制,说明质膜NADPH氧化酶和质膜Na+/H+逆向转运体系参与盐诱导H2O2的产生。盐胁迫也可诱导木榄Ca2+内流,可被质膜Ca2+通道抑制剂LaCl3、Amiloride以及Vanadate抑制,说明质膜Na+/H+逆向转运体系参与调控由质膜Ca2+通道介导的Ca2+内流,引起胞质Ca2+浓度升高,产生Ca2+信号。(C)外源H202促进盐诱导的Ca2+内流,可被DPI抑制;瞬时H202处理可促进木榄Ca2+内流,也可被LaCl3抑制,证明H2O2可诱导由质膜Ca2+通道介导的Ca2+信号的产生。(2)对秋茄实施同样的实验,证明H202对秋茄根系K+/Na+平衡有正向调控作用。外源Ca2+对秋茄根尖K+/Na+平衡调控的具体机制还有待研究。(3)SNP(一种NO供体)可抑制盐诱导的秋茄根尖K+外排,但对木榄作用不明显。 4.以秋茄幼嫩叶片为材料,通过PCR扩增克隆(?)cTIP1基因并构建其表达载体,采用根癌农杆菌介导法,对烟草实施KcTIP1基因的遗传转化,通过卡那霉素筛选和基因组PCR以及RT-PCR鉴定,获得转基因再生植株。选取其中两个阳性株系和野生型株系进行耐盐性测试,并测定对照植株与盐处理植株根、茎、叶的鲜重,光合参数,叶片组织Na+、K+浓度及根尖Na+、K+流速,探究KcTIP1基因在耐盐性中的作用。氨基酸多重序列比对结果显示,克隆到的KcTIP1基因编码的蛋白包含MIP家族的特征序列SGGHVNPAVT和2个保守的NPA(Asn-Pro-Ala)位点。因此认为,KcTIP1具有与其他水通道蛋白类似的蛋白结构和酶学功能。基因组PCR与RT-PCR检测结果显示,KcTIP1基因已经在转基因烟草株系中成功表达。150mmol/L NaCl处理7天后,转基因株系的根、茎、叶鲜重,叶片光合速率与蒸腾速率均高于野生型。此外,叶片组织Na+、K+浓度与根尖Na+、K+流速测定结果表明,盐胁迫下,转基因烟草根系Na+、K+吸收加强,叶片Na+、K+积累加强,导致叶片Na+/K+的增幅小于野生型,初步说明KcTIP1过表达可调节光合速率与蒸腾速率,提高转基因烟草的耐盐性;还可通过加强Na+、K+积累,加强渗透调节来提高耐盐性,并初步推钡(?)KcTIP1在调节K+/Na+平衡方面有贡献。


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