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蓝莓花青素拮抗化学性肝损伤及相关机制研究

陈健  
【摘要】:蓝莓花青素是蓝莓中天然存在的一类生物活性物质,具有重要的生理功能和开发应用前景。为实现蓝莓花青素的综合利用,本文以栽培的蓝莓果(品种为爱国者)研究对象,在蓝莓花青素分离纯化的基础上,对制备的花青素单体进行了结构鉴定。并通过建立急性小鼠肝损伤模型,探讨了蓝莓花青素对四氯化碳(CCl4)诱导小鼠的肝损伤的保护和氧化应激的影响,结合其体外清除自由基抗氧化活性和对CCl4诱导的L-02肝细胞损伤的保护,从抗氧化的角度探讨了蓝莓花青素对肝损伤保护作用的主要机制。主要研究结果如下: (1)蓝莓果中花青素类物质的最佳提取工艺参数为:0.5%三氟乙酸-甲醇为提取溶剂,料液比为1:15,p H为2.5,加酶量3%,酶解温度70℃,酶解反应时间1h。在此条件下,经HPLC法测定,鲜果中花青素含量为5.65mg/g。 Amberlite XAD-7大孔树脂对蓝莓花青素表现出良好的吸附与解吸性能,是分离纯化蓝莓花青素的理想树脂。Amberlite XAD-7树脂的优化动态吸附条件为:蓝莓花青素液浓度2.5mg/mL, pH2.5,进样速率1.0mL/min;优化洗脱条件为:甲醇浓度70%,洗脱速率1.0mL/min,洗脱体积10BV。在此条件下,Amberlite XAD-7树脂对蓝莓花青素的动态吸附量达最大值18.5mg/g,动态解吸回收率达87.15%。 通过制备型高效液相色谱制备出三种主要的花青素单体,经过结构鉴定,组分1为锦葵色素-3-半乳糖苷(M3G),纯度为95.49%:组分3为矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G),纯度为98.57%;组分6为矢车菊素-3-芸香苷(C3R),纯度为96.34%。这三种单体占花青素的含量分别为12.76%、60.68%和15.87%。 (2)蓝莓花青素具有一定的抗氧化活性,在DPPH自由基清除实验和β-胡萝卜素/亚油酸自氧化体系中,相同浓度下,其作用效果优于抗坏血酸。蓝莓花青素分离的三种单体总抗氧能力表现为C3GC3RM3G,且半抑制浓度(IC50值)表明,矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)清除过氧烷基及DPPH自由基的能力最强(P0.05),从而进一步说明其为蓝莓花青素中有效的抗氧化活性成分之一。 (3)小鼠摄入蓝莓花青素后的低(0.5g/kgbw)、中(1.0g/kgbw)、高(2.0g/kg bw)剂量组经CCl4诱导的急性肝损伤小鼠的肝酶活性较模型组显著降低(P0.05),血清和肝脏中丙二醛(MDA)的生成量显著减少(P0.05),超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性明显增强(P0.05),肝脏组织的总抗氧化能力(T-AOC)显著提高(P0.05):由CCl4引起的肝脏组织气球样变、脂肪变性、炎症浸润等病理学损伤,喂食蓝莓花青素后,均可得到明显改善。 (4)通过建立CCl4对人胚胎肝细胞株L-02的损伤模型,结果表明:CCl4诱导L-02肝细胞损伤的最适损伤浓度为20mmol/L,(?)员伤时间为6h。经CCl4损伤后模型组细胞存活率仅为45.68%,上清液肝酶活性显著升高(P0.05),脂质过氧化产物MDA含量显著增加(P0.05)。蓝莓花青素可一定程度地改善L-02肝细胞损伤,能明显提高肝细胞的存活率,减少肝酶的释放,存在明显剂量效应关系(P0.05)。蓝莓花青素中的三种主要成分单体的抗肝损伤体外细胞试验结果表明,C3G对提高细胞存活率和细胞抗氧化水平作用最好,且与其它两种单体间存在显著性差异(P0.05)。最终证明了蓝莓花青素中有效的抗肝损伤活性单体为矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)。 细胞克隆形成抑制实验、细胞周期DNA含量分析法及Annexin V-FITC/PI双染色检测法的结果表明,矢车菊素-3-葡萄糖苷保护L-02正常肝细胞的形式是减少细胞的坏死。免疫印迹法检测调控细胞凋亡中的关键蛋白Caspase-3的含量变化进一步说明,矢车菊素-3-葡萄糖苷抑制L-02细胞因损伤而坏死的机理为Caspase依赖型,而细胞损伤可能是通过线粒体相关途径实现的坏死过程。


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