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基于高通量测序的瓜叶菊花青素苷合成途径研究

金雪花  
【摘要】:瓜叶菊(Senecio cruentus Masson ex L'Herit)是菊科千里光属多年生草本植物,花色丰富,色系分明。本研究以瓜叶菊‘小丑’系列蓝色、洋红色、粉色及白色品种为研究对象,利用转录组测序、qPCR表达分析、HPLC色素分析的方法,探讨瓜叶菊花青素苷不同分支途径形成的分子机理,为基于分支调控的花色改良提供依据。本研究主要取得了以下成果: 1.色素分析表明瓜叶菊‘小丑’品种系列中的蓝色系花青素苷合成以飞燕草素分支途径为主,粉色系以天竺葵素分支途径为主,二者同时并行矢车菊素分支途径。而洋红色系中矢车菊素分支途径占绝对优势,同时存在飞燕草素分支途径。花青素苷不同分支途径产物在花序发育不同阶段舌状花中的积累模式均呈现先上升后下降的趋势。白色系含有花黄素,而检测不到花青素苷,可作为对照材料。根据这一研究结果认为瓜叶菊是研究花青素苷合成途径及其分支调控机制的重要材料。 2.利用Illumina/Solexa高通量转录组测序技术,对蓝色瓜叶菊不同发育阶段舌状花进行转录组深度测序,获得了52,879,884条90bp的高质量的短序列,采用组装软件Trinity将短reads做转录组从头组装,共获得了57,818条unigene,平均长度为708bp (N501074bp),从而构建了蓝色瓜叶菊舌状花转录组数据库。 3.通过Nr注释有43,367条unigenes(占所有unigene的75.0%)可直接确定其CDS区和序列方向。GO功能分类及KEGG代谢通路分析结果表明,瓜叶菊舌状花发育过程中与代谢过程、细胞生理过程、刺激反应及生物调节过程相关基因大量表达,且细胞代谢、次生代谢及植物激素信号传导的基因起到重要的调控作用。进一步对花青素苷合成相关基因进行总结分析,筛选出了花青素合成及其化学结构修饰基因、转录因子和转运体编码基因,发现这些基因大部分以多基因家族的形式存在。 4.筛选出了在瓜叶菊舌状花中稳定表达的内参基因。在蓝色和粉色系品种不同发序育阶段的舌状花中SAND和Actin表达最为稳定,白色系不同花序发育阶段舌状花中(?)rIP41和Actin、红色系PP2A和Actin稳定性较好。在对瓜叶菊4个花色品种不同花序发育阶段舌状花中的基因表达情况进行分析时,使用SAND, Actin和PP2A三个组合即可获得较为精确的基因表达结果。 5.通过qPCR方法对转录组数据库中筛选的花青素苷合成相关11个基因的家族不同成员在4个花色品种5个花序发育阶段舌状花中的表达模式进行分析发现,不同成员表现出不同的表达谱,参与花青素苷合成途径的是其中一些特定成员。同时筛选出了调控不同分支途径的关键基因特定成员:ScF3'5'H和ScGT2只有在具有飞燕草素分支途径的样本中才有表达;在洋红色系中促进矢车菊素分支途径形成的是ScF3'H1;而在具有天竺葵素分支途径的样本中,ScF3'5'H无表达信号,ScF3'H低表达。色素及基因表达分析结果表明,调控各分支途径的关键基因的表达量与相关分支代谢产物量正相关。 6.通过qPCR表达模式分析,初步筛选出调控ScF3H1、ScDFR1和ScANS的转录因子编码基因ScBHLH17。 7.分离得到了GST基因家族的10个成员,序列及表达模式分析结果表明ScGST3是瓜叶菊花青素苷相关转运体。 上述研究结果表明,花青素不同分支途径是由关键基因特定成员调控。本研究首次利用Illumina/Solexa测序平台对瓜叶菊进行高通量测序,并对通过测序获得的相关序列,进一步利用qPCR技术进行大范围的表达模式分析筛选出关键调控基因,同时筛选出了花青素苷转运体编码基因。依据上述结论初步解析了瓜叶菊花青素苷合成途径不同分支之间的竞争机制,为花色改良,特别是蓝色花育种提供宝贵基因资源,具有重要的理论及实际意义。


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