农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化枣树增强抗性的研究

【摘要】：壶瓶枣(Zizyphus jujuba Mill.)是中国优质枣品种之一,但真菌性病害已严重制约了壶瓶枣生产；白藜芦醇作为植物次生代谢产物不但能提高果树抗真菌能力,还具有具有众多的药理和保健功能,其中最令人瞩目和具有发展前景的是其抗肿瘤、心血管保护、抗氧化功能。大量研究表明,遗传转化STS基因能够增强植物的抗真菌能力,本研究的目的为芪合酶基因遗传转化枣树提高枣树的抗真菌病害能力和改善枣的果品品质。壶瓶枣作为山西太谷的地理标识品种,经济价值高,产业发展前景好。白藜芦醇在虎杖根中含量较高,前期研究从虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)根中分离得到白藜芦醇合成芪合酶关键基因PcPKS5(EU647245),具有高效催化合成白藜芦醇功能。本研究通过组织培养与遗传转化技术,对壶瓶枣优良单株进行组织培养,即获得高效茎尖和茎段诱导的丛生芽建立植物再生体系,构建虎杖芪合酶基因植物表达载体,转化农杆菌,将虎杖白藜芦醇生物合成关键基因PcPKS5遗传转化壶瓶枣。结果如下：(1)优化壶瓶枣径段诱导得到高分化率的丛生芽遗传转化体系。将壶瓶枣再生体系材料剪成0.8-1.0 cm含茎尖和茎段的外植体,农杆菌侵染菌液中浸泡15.0min,集中置于培养基上共培养3天,避光培养,转入含Cb300 mg/L, AS 60 mg/L丛生芽诱导分化培养基中培养5-6周。将分化丛生芽转接至含4.0mg/L Basta,5-6周检测阳性植株,为壶瓶枣成功实现遗传转化奠定了基础；(2)成功将狗头枣叶片外植体材料诱导出愈伤组织,并分化得到完整植株,并建立了狗头枣叶片再生遗传转化体系；(3)壶瓶枣遗传转化材料经Basta筛选、GUS显色、gDNA PCR、RT-PCR等检测证实,成功获得到3个阳性转基因壶瓶枣株系,荧光实时定量检测RNA瞬时表达得到其中株系2表达效率高于其他两个株系。经植物化学成分鉴定遗传转化植株中存在白藜芦醇,研究结果表明转化植株中虎杖芪合酶在壶瓶枣异源表达,目的基因表达代谢生成目标产物白藜芦醇,其鲜重含量为0.45μg/g,抑菌效果相当于1ug/ul白藜芦醇样品(抑菌率平均为23.08%),具备抗真菌桃褐腐(Monilinia fructicola)真菌、枣假尾孢(Isariopsis imdica var. Ziziphi)、细交链孢菌[Alternaria alternate(Fr.)Keissler]的能力。同时相对野生型植株,朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)有趋避遗传转化植株的现象发生。本研究在壶瓶枣成功遗传转化虎杖芪合酶基因,获得壶瓶枣遗传转化新材料。且PcPKS5在枣树中异源表达,转基因材料中能够代谢合成白藜芦醇,提高转PcPKS5基因壶瓶枣抗枣树病原真菌病能力,研究结果为发掘枣树新的种质资源提供技术途径。有关壶瓶枣遗传转化材料是否在果实中积累,改善果品品质仍需深入研究。