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HDT1组蛋白去乙酰化酶和MYB221转录因子调控植物形成层及木质部的生长发育

张永卓  
【摘要】:植物形成层具有多功能干细胞的特性,能不断增殖和分化,是植物根、茎伸长和增粗的前提条件;木质部通过次生生长、木质素积累、细胞壁沉积,最终形成木材。植物特异的组蛋白去乙酰化酶HD2家族参与调节组蛋白乙酰化程度,进而调控基因表达,参与细胞增殖和分化。MYB作为一类转录因子广泛参与木质部中木质素、细胞壁的合成。为了深入了解组蛋白去乙酰化酶与MYB转录因子在调节木质部发育中的机制,本论文使用拟南芥(Arabidopsisthaliana)和毛白杨(Populus tomentosa)作为研究材料,首先通过转录组分析组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA对毛白杨悬浮细胞生长和基因表达的影响;进而使用拟南芥组蛋白去乙酰化酶hdtl突变体研究HDT1基因对形成层增殖和木质部分化的影响;同时探讨MYB221基因对杨树木质部发育和木质素合成的分子机制。具体结果如下:利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理毛白杨悬浮细胞,观察发现:与对照组相比,TSA处理后的悬浮细胞形态发生改变,且在H3K9和H3K27位点的乙酰化水平升高。经过转录组分析发现有4 465个基因表达存在显著差异,其中2 363个差异基因上调,2 102个差异基因下调。差异基因主要富集在细胞周期、苯丙素生物合成、细胞壁组分和乙酰化相关途径。其中有11个WRKY转录因子和11个MYB转录因子上调,包括调节细胞壁组分重建的MYB87、与细胞分裂有关的MYB59和调控黄酮生物合成的MYB29;同时包括IAA8在内的5个IAA转录因子下调以及对木质素合成相关的MYB85、MYB101、MYB221转录因子的下调。说明TSA通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性,直接或者间接影响了细胞增殖、分化、细胞壁组分和木质素合成途径相关基因,从而影响细胞的生长。通过半定量PCR检测拟南芥组蛋白去乙酰化酶组织特异性表达分析发现,HDT1在茎中表达较高。以拟南芥组蛋白去乙酰化酶hdtl突变体为实验材料,观察发现hdtl突变体植株在整个生长发育过程中明显弱于野生型。经过石蜡切片观察发现hdtl突变体茎的横截面积比野生型拟南芥减少了 34.92-38.10%;透射电镜观察发现hdtl突变体木纤维细胞数量比野生型增加了 21.25-22.50%;hdtl突变体木纤维细胞壁的厚度增加了 22.48-29.36%(P0.05);同时hdtl突变体木质素含量比野生型增加了22.32-27.09%。转录组比较分析显示:hdtl突变体茎中基因表达差异显著,其中127个基因显著上调,45个基因显著下调。其中生长素信号传导的相关基因(IAA2和IAA19)、木质素合成的相关基因(PAL1、LAC8和LAC17)以及纤维素合成的CESA基因家族表达差异显著。以上结果显示,HDT1基因的缺失导致了茎节变细、木纤维细胞数量增加、木纤维细胞壁厚度增加以及木质素含量增高,说明HDT1影响了形成层增殖分化和木质部的发育。选取之前转录组分析改变较大的MYB家族进行基因的筛选和进化树分析,发现MYB221与参与木质素合成拟南芥AtMYB4的进化关系最近,并且通过生物信息学分析、数据库比对,得出MYB221长1 638 bp,属于R2R3-MYB蛋白,编码269个氨基酸,蛋白分子量29 854 Da,预测其等电点为8.67。随后通过荧光定量PCR确定MYB221在根、茎、叶中均有表达,且在茎中的表达量最大。克隆MYB221基因并与表达载体pBI121连接,构建了正义、反义载体,并通过农杆菌侵染法将MYB221正义、反义载体转入741毛白杨,最终鉴定获得两株正义转基因株系MYB221Z1、MYB221Z12和1个反义转基因株系MYB221F1。表型分析发现MYB221正义毛白杨生长正常,而反义转基因植株生长严重受阻。对MYB221正义毛白杨进行木质素含量测定,发现其木质素含量在根、茎、叶均高于野生型,且在茎中最为明显。与野生型相比,MYB221Z1茎中的木质素的含量增加了 23.55%,MYB221Z12茎中木质素的含量增加了 16.73%。石蜡切片发现,与野生型毛白杨相比,正义MYB221植株木质部面积增加了 101.82-133.66%,木质部中导管数量增加36.54-48.08%。通过正义MYB221转基因植株检测,说明MYB221转录因子可以参与木质部的形成。本研究表明,HDT1与MYB221转录因子共同参与了木质部的发育,HDT1可能通过直接或间接影响MYB等转录因子或木质部发育相关基因的表达来实现该功能的调控。


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1 张永卓;HDT1组蛋白去乙酰化酶和MYB221转录因子调控植物形成层及木质部的生长发育[D];北京林业大学;2018年
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