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灵芝产胞外多糖的液体培养基优化及其结构初步解析和抗氧化活性研究

孟歌  
【摘要】:灵芝((Ganoderma lingzhi Sheng H.Wu,Y.CaoY.C.Dai),隶属于多孔菌目(Polyporales)、灵芝科(Ganodermataceae),是2012年在我国华北地区发现的新种。灵芝多糖是灵芝最主要的活性成分之一,在生化和药物领域中具有多种潜在的药理学价值。因此,本研究开展了以下工作:(1)基于多个生理指标,对灵芝液体培养过程中的抗氧化活性进行了评价:结果发现灵芝在液体培养过程中具有较高的抗氧化活性,体现在液体培养过程中生长代谢旺盛,可分泌大量多糖、多酚、黄酮、AA等物质和SOD等酶类,对羟自由基、超氧阴离子、DPPH自由基及ABTS自由基等的清除效果显著,且具有较强的FRAP和亚铁离子螯合作用,这也说明该菌的抗氧化活性与其自身的生长状况、次级代谢产物分泌及还原能力等密切相关。此外,一定的环境胁迫压力也可以激发该菌启动自身的抗氧化系统以保护机体免受氧化损伤。(2)利用响应面设计设置试验并建立数学模型,获得灵芝产胞外多糖的最适液体培养基:以胞外多糖产量为响应值,利用Plackett-Burman设计、最陡爬坡设计、Box-Behnken设计建立数学模型,获得灵芝产胞外多糖的最适液体培养基为:葡萄糖59.62 g/L、酵母浸粉 10.03 g/L、CaC03 0.2 g/L、维生素 B1 45.13 mg/L、KH2P04 1.0 g/L、蛋白胨 1.5 g/L、吐温 80 10.26 mL/L、ZnS04 0.3 g/L、甘露醇 1.5 g/L、MgS04 0.5 g/L、天冬氨酸8.86 g/L。在此优化培养基条件下得到的灵芝胞外多糖产量为3.57±0.21 g/L,与理论值3.53 g/L相近,且比优化前提高了 3.16倍,说明该响应面设计对于优化液体培养基以提高灵芝胞外多糖产量切实可行。(3)利用醇沉法提取分离灵芝胞外多糖,对其总糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量、分子量、单糖组成、光谱性质等结构特征进行了初步解析:灵芝在上述最适培养基条件下进行液体培养,收集的发酵液经浓缩、醇沉、Sevag法除杂、透析、冷冻干燥后获得胞外多糖GLEPS,提取率为35.37%。GLEPS的总糖含量和糖醛酸含量分别为87.97%和21.74%,未检测到蛋白质。经高效凝胶渗透色谱测定GLEPS的分子量为475000和21.6 kDa。经高效离子交换色谱确定该胞外多糖是一种异质多糖,其单糖组成为0.67%L-阿拉伯糖、0.91%D-半乳糖、12.47%D-葡萄糖、50.75%D-甘露糖、21.24%L-鼠李糖、3.21%D-木糖、1.57%半乳糖醛酸和9.17%葡萄糖醛酸。红外光谱分析显示GLEPS结构中含有α-糖苷键。(4)系统评价了不同浓度灵芝胞外多糖的体外抗氧化活性:将上述得到的灵芝胞外多糖GLEPS配制成不同浓度的溶液,系统评价了其体外抗氧化活性,发现各指标均在2.0 mg/mL时达到最大值,且清除能力与浓度呈正相关。此外,GLEPS的抗氧化能力在一定浓度时均超过了阳性对照,说明其具有较高的抗氧化活性,可被开发成一种新的天然抗氧化剂应用于保健食品或药品中。以上结果为更好地研究、开发和利用药用真菌灵芝提供了基础资料。


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