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甘菊木质素合成相关NAC转录因子功能及其基因编辑

王海  
【摘要】:菊花(Chrysanthemum morifolium)是世界重要的观赏花卉,植株的抗逆性、枝干硬度是影响其品质的重要因素。木质素是植物细胞次生壁的重要组成成分,其含量以及相关酶的表达是影响植物植株形态、茎秆硬度、抗逆性等的重要因素。NAC类转录因子是植物特异性转录因子,其成员NST、SND、VND等基因均作用于植物次生壁合成调控网络上游,在木质素合成中发挥重要作用,对其进行调控能够同时影响多个侧生代谢途径,产生更多的功能及表型差异,对植物育种有重要意义。然而,有关木质素调控的NAC转录因子在菊花中的作用尚少见报道。甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)是现代菊花的重要亲本之一,也是菊科植物研究的模式植物,但是甘菊木质素相关转录因子的研究和甘菊基因编辑体系的研究均未见报道。因此,本研究对甘菊木质素调控相关的NAC转录因子进行研究,明确甘菊NAC转录因子的功能,并对其进行基因编辑研究,通过基因编辑技术进行甘菊木质素调控育种,以期为NAC转录因子家族在菊花中的作用提供理论基础,同时为现代菊花的生长发育及抗逆调控分子育种提供新的途径。主要研究结果如下:(1)通过菊花脑(Chrysanthemum nankingense)基因组数据库鉴定出153个推测的NAC转录因子,并构建了无根系统发育树,将其分为2个组和19个亚族,其中已知亚族17个,未知亚族2个,组1中包含了15个亚族共111个成员,组2中包含了5个亚族共42个成员。通过已有研究对各个亚族的功能进行分析,发现Os NAC7亚族成员包含了SND/NST/VND/BRN蛋白的共12个成员,其成员在已知研究中均有调控木质素积累的功能,因此,后期的研究主要围绕木质素相关的Os NAC7亚族进行;(2)分别对甘菊不同生长时期的不同组织和20%PEG 6000诱导渗透胁迫、200mmol/L Na Cl诱导盐胁迫的甘菊进行Os NAC7亚族12个成员的表达模式分析,发现12个成员均参与了茎的生长调控,其中只有1个基因在生长60天的茎的老化过程中起作用,其它11个成员都在生长44天的茎的快速生长过程中起主要作用;5个成员调控根的生长发育;5个成员参与了叶的生长调控,且在叶中表达量较高的时期都在生长60天的老化期;同时12个成员也都参与了干旱和盐胁迫调控,其中有5个基因可能在甘菊渗透胁迫调控中起关键作用,8个基因可能是甘菊盐胁迫响应的重要基因;(3)克隆了甘菊Os NAC7亚族中的4个成员,并对其进行模式植物中的功能验证,发现Cl SND1基因能够增加转基因烟草茎的次生细胞壁厚度及次生木质部厚度,并通过调节根的生长提高烟草幼苗对盐或低温的耐受性,其转基因烟草还出现了生长势减弱和提前开花的表型;Cl SND1.1、Cl VND1和Cl BRN1基因均能够促进胁迫条件下拟南芥幼苗侧根的生长,提高拟南芥幼苗对盐或低温的耐受性,并且导致拟南芥生长势减弱和开花提前;在西藏扁芒菊、紫花亚菊、天门山菊、灰叶女蒿、贺兰山女蒿、甘菊、蒙菊和北极菊中对木质素调控开关转录因子SND1进行了克隆及进化分析,发现薇甘菊、向日葵、莴苣和菜蓟的分化时间早于西藏扁芒菊、除虫菊、紫花亚菊、天门山菊、黄花蒿早于灰叶女蒿、贺兰山女蒿、甘菊、蒙菊和北极菊;(4)对43株甘菊实生无菌苗的叶片进行相同培养条件下的再生试验,发现不同甘菊单株的叶片对激素响应存在差异,再生系数0-3.8不等,通过再生试验明确了不同甘菊单株对激素响应的差异,并筛选出了甘菊的高效再生单株,直接再生培养体系为:MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂。对高效再生单株进行潮霉素抗性筛选,直接再生的潮霉素抗性筛选最佳浓度为8mg/L,生根筛选培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+4mg/L潮霉素;(5)对甘菊的4个actin基因启动子及拟南芥At UBI启动子通过瞬时转化进行菊科植物中的表达效率试验,并用其改造基因编辑载体用于Cl SND1基因的单靶点编辑和双靶点编辑试验,已获得5株转基因甘菊,其DNA检测为阳性,但是茎和叶的RNA中均没有检测到载体序列,且靶位点没有发生突变,造成该结果的原因可能与基因的选择有关,也可能与甘菊染色体的浓缩程度有关,该问题需要进一步的研究证实。本研究对菊花脑NAC家族进行分析并在甘菊中对木质素相关的Os NAC7亚族进行表达模式研究和其4个成员的模式植物功能研究;同时建立了高效的甘菊再生体系,并使用甘菊4个actin启动子改造基因编辑载体,对已验证的甘菊SND1基因进行基因编辑试验。以期在甘菊中对SND1基因进行功能验证,并进行甘菊木质素调控育种,为研究为甘菊木质素研究及基因编辑研究提供理论及技术基础。


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