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兔防御素基因NP-l的异源表达及蛋白纯化研究

李霞  
【摘要】:防御素是一种生物体内源的、具有广谱微生物抗性的小分子短肽,对细菌、真菌、和被膜病毒(例如艾滋病病毒等)以及某些恶性肿瘤细胞都具有广谱的毒杀效应。防御素在生物体内的含量极少,直接提取成本太高,因此,通过基因工程途径来大规模生产防御素具有巨大潜力。 源白兔嗜中性细胞的α防御素NP-1(Neutrophil Peptide-1)是目前所发现的30多种防御素中抗性谱最广的防御素之一。本文将NP-1基因分别构建入原核和真核表达载体,转入大肠杆菌和小球藻中,通过诱导使防御素蛋白在不同的宿主细胞中表达,并利用亲和层析纯化目的蛋白。另外,通过对不同顺式作用元件的比较,确立了适合小球藻外源基因高效表达的5’上游调控元件。为防御素的医药开发和进一步研究防御素的活性机理奠定了基础。具体研究内容及结果如下: 1.通过构建NP-1原核表达载体,将该基因转入大肠杆菌,并以融合蛋白的形式表达。通过该融合蛋白的特异亲和层析,分离目的蛋白,所得样品进行蛋白电泳,检测到以二聚体形式存在的防御素蛋白。然而,蛋白活性检测发现大肠杆菌表达的防御素蛋白无抑菌活性,说明以原核生物为生物反应器,来生产真核生物防御素蛋白的方法行不通。 2.因此,又将兔防御素基因转入了一种单细胞真核生物——小球藻中。首先,为了便于将来分离提纯目的蛋白,通过PCR扩增法在NP-1基因前方加入了6个组氨酸残基,得到His-NP-1片段,构建His-NP-1真核表达载体,通过电激转化将His-NP-1转入小球藻中。抗性筛选、PCR检测、Southern点杂交检测、转基因小球藻总蛋白抑菌分析、蛋白电泳等检测证明NP-1基因已稳定整合到小球藻基因组中,并进行了正确转录和表达。 3.由于外源基因的表达活性与上游调控元件有很大的关系,为提高防御素蛋白在小球藻中的表达活性,本论文构建了五种不同的真核表达载体,此五种载体,分别含有五种不同的上游调控元件(Ubiqitin启动子+Ω增强子序列、NR基因启动子、NR基因启动子+Ω增强子序列)。将这五种表达载体分别转入小球藻中,通过检测其驱动NP-1基因表达的强弱,找到了最适合在小球藻中驱动外源基因表达的上游调控元件。 4.通过组氨酸残基与镍离子特异亲和的方法提纯目的蛋白,得到了防御素蛋白,简化了目的蛋白的分离过程。为防御素的医药开发和进一步研究防御素的活性机理奠定了基础。


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