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根癌农杆菌介导的AP1基因转化菊花的研究

吕晋慧  
【摘要】:菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是我国的传统名花和四大切花之一,花期相对集中,大都在秋季。春菊、夏菊品种少。花分生组织特征基因AP1的异源表达可以加快花发育进程,使菊花花期提前。利用基因工程技术导入AP1基因改变现有观赏性较高的菊花花期有重要意义,国内外尚未见相关报道。本研究是在国家科技部转基因研究与开发专项(JY03-B-28)项目支持下完成的。作者通过近4年的研究从9个品种中筛选出三个菊花品种‘紫妍'、‘黄秀芳'、‘玉人面'的高频再生体系。建立并优化了遗传转化体系,首次把花分生组织特征基因AP1转入地被菊‘玉人面'中,获得了11株转基因植株,并在此基础上筛选出两株花期提前的株系。主要研究结果如下: 1.以MS为基本培养基,采用了4种不同类型的生长调节剂组合,从中筛选出适合菊花叶片外植体再生的生长调节剂组合是6-BA和NAA,并在此基础上比较探讨了不同激素配比、不同基因型、不同生理状态的叶片、外植体类型、继代培养时间及添加剂AgNO_3等因素对不定芽再生的影响。研究结果表明:菊花再生对基因型具有依赖性,9个品种中只有3个品种:‘紫妍'、‘玉人面'、‘黄秀芳'可以高频再生,再生率分别为93%、96%、95%;不同生理状态的叶片再生能力不同,15~25d苗龄的菊花无菌苗中上部充分展开的幼嫩叶片再生率最高;不同菊花品种的同种外植体再生能力不同,同品种的不同外植体再生能力也不同,其中‘紫妍'、‘黄秀芳'、‘玉人面'、‘L12M57'的叶片再生能力显著高于‘神马'叶片再生能力。‘黄秀芳'的茎段、叶片、叶柄均可高频再生,其它品种的叶片再生能力高于其它外植体的再生能力;继代培养时间影响菊花叶片外植体的形态发生能力的保持或丧失。总体规律是随着继代次数增加叶片外植体形态发生能力下降。但不同品种保持高的形态发生能力的时间不同;AgNO_3对不同品种的再生率影响不同,但都未能提高再生率和不定芽数量;不适宜的培养条件和不同来源的外植体影响‘紫妍'叶片的再生能力。Vc、活性炭未能克服‘紫妍'外植体的褐化现象,而高浓度的生长素(NAA)有效抑制紫妍外植体的褐化现象,再生率提高。 2.构建了植物表达载体pBI-AP1,并通过液氮冻融法将植物表达载体pBI-AP1导入农杆菌EHA105、LBA4404中。 3.研究讨论了不同菊花品种对不同抗生素的敏感性,研究认为10mg/L的G418是菊花品种‘紫妍'、‘玉人面'叶片外植体筛选培养的临界耐受浓度。20mg/L的卡那霉素是‘黄秀芳'叶片筛选培养的临界浓度和生根筛选的临界浓度。400mg/L以上浓度抑菌素均不同程度影响叶片外植体的再生率和平均再生不定芽数,其中头孢霉素比羧卞青霉素抑制作用强。两种抑菌抗生素对菊花苗生长的影响总体规律是随抗生素浓度的递增,菊花苗生根数量递增、根长递减、苗高降低。其中头孢霉素对菊花的抑制


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