福志贺氏菌两个基因克隆蛋白表达纯化和结晶筛选及sf2088聚合状态分析

【摘要】： 志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌，是引起人类细菌性痢疾的主要致病源。在全世界范围内，每年约有1.6亿人感染志贺氏细菌性痢疾，其中约有一百万人死亡，死亡人群以发展中国家的5岁以下的儿童为主。每年因痢疾死亡的人中50％系由福氏志贺氏菌引起，该类型痢疾大都发生在发展中国家，同时福氏志贺氏菌的致死率也高于其他种属的志贺氏菌。由于目前对福氏志贺氏菌的预防和治疗的不足，世界健康组织(The World HealthOrganization)把抗痢疾药的研制放在首要的位置。因此，该类菌的结构基因组学的研究具有重要的研究意义。 本课题开展了对福志贺氏痢疾杆菌的两个重要蛋白质的结构生物学研究。我们以福志贺氏痢疾杆菌2a型301株全基因组为模板、以pET22b-(+)为载体、克隆了两个关键基因：组氨酸合成途径中双功能酶PR-ATP焦磷酸水解酶和PR-AMP解环酶sf2088(该酶尚无文献报导被表达，PDB中亦无同源结构)，细菌转运铁蛋白sf2523。以宿主菌BL21(DE3)为宿主菌进行表达，通过表达筛选，我们获得了两种蛋白的可溶表达。然后经过His-tag标签的亲和柱层析、mono-Q离子交换柱层析和G-75分子筛凝胶过滤层析等三步纯化，并进行了纯化条件(纯化温度控制、buffer的配比、PH值及添加剂的量)的摸索，我们得到了均一性稳定性都较好的蛋白质样品。根据肽指纹质谱实验结果与数据库肽段序列比对，我们确认了表达的目标蛋白身份，同时分子量质谱和SDS-PAGE实验结果也证明了这一点。我们又采用Hampton Research公司的结晶试剂盒以悬滴气相扩散法进行预结晶实验，然后经过晶体生长条件的优化，我们得到了相应蛋白的单一晶体。这为该蛋白的结构解析打下了坚实的基础。同时我们还进行了晶体衍射实验，sf2088晶体的衍射分辨率在10埃以上，sf2523的晶体没有衍射。相关的晶体优化实验正在进行中。 为了进一步探索蛋白的凝聚状态和其buffer配比条件的关系，我们利用中国科学院生物物理所蛋白质研究平台，采用动态光散射、分析超速离心等实验手段，对纯化后的蛋白进行了一系列实验，试验结果发现一定浓度的锌离子对稳定其聚合状态具有非常重要的意义。通过进一步正交实验，发现50mM Tris-HCl，pH8.0，300mM NaCl，0.05mM ZnCl_2的buffer条件可以保证蛋白在20天内保持稳定均一的状态。这对我们进一步摸索该酶的结晶条件进而获得适于衍射的晶体具有重大的意义