仙客来体细胞胚胎的发生、变异及其蛋白质组学研究

【摘要】： 仙客来(Cyclamen persicum Mill.)是一种重要的观赏花卉,研究表明通过器官发生途径或体胚发生途径繁殖,后代都存在变异现象。为了揭示体胚发生机制和体胚变异的原因,提高快速繁殖效率,本研究对仙客来体细胞胚胎发生的条件、生物学特性和蛋白质组学进行了研究,主要结果如下: 以仙客来种苗为试材,接种于不同浓度激素组合的1/2MS培养基上,结果表明球茎是较好的诱导胚性愈伤的材料,1/2MS+6-BA0.2mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5 g/L+肌醇100mg/l+酪蛋白100mg/l是较好的诱导条件。此结果为仙客来体胚变异和发生机制的研究提供了实验基础,同时为其快速繁殖奠定了技术基础。 为获得大量且一致的体细胞胚胎,对仙客来的愈伤组织进行了悬浮培养,分别建立了胚性和非胚性细胞悬浮培养体系。确定了胚性细胞悬浮培养体系的最适初始细胞浓度和生长周期,分别为PCV 8%和两周,同时发现非胚性细胞悬浮培养体系的生长周期与初始浓度有关。 以仙客来胚性愈伤和不同时期体胚为材料,进行了细胞学和组织学研究。结果表明,胚性细胞多分布于愈伤组织的表层,少量胚性细胞团分布于深层,由非胚性细胞包围。表层体胚的发生存在单细胞起源和可能的多细胞起源,单细胞起源的原胚有胚柄,分别依次经过多细胞原胚、球形胚、鱼雷形胚发育阶段。 对仙客来的胚性愈伤进行固体培养基培养和液体悬浮培养,分别获得了大量体胚,依据体胚萌发后的状态不同进行统计,固体培养基上得到10.9%的正常体胚,其体胚变异机率为89.1%,悬浮培养得到6.25%的正常体胚,变异机率为93.75%。对不同类型的体胚进行组织学观察,结果表明,仙客来体胚存在的变异可能是由于胚胎的极性异常所致。 为更好的理解仙客来胚胎的发育途经及体胚变异的原因,通过对不同发育时期的体胚与合子胚进行组织学观察,比较了仙客来体胚与合子胚的发育过程。结果表明,二者发育途径基本一致,都经过球形胚和鱼雷胚时期、有一片子叶,不同的是合子胚形成的同步化程度高,同时伴随着发达的胚乳的形成;体胚的变异可能在初期胚母细胞时期就有表现。 随着愈伤组织继代次数的增加,变异的机率加大,为减少变异,对仙客来愈伤组织进行了超低温冷冻保存研究。以继代后处于对数生长期的愈伤组织为实验材料,首先在含有不同蔗糖浓度的培养基上预培养不同时间,转至不同的冰冻保护剂中直接液氮冷冻或-20℃预冷冻2小时,然后液氮超冷冻保存,37℃水浴迅速解冻,并用相应蔗糖浓度的液体培养基洗涤,以中性红染色测定细胞的存活率,SPSS13.0软件进行统计学分析。结果表明,预培养基中蔗糖浓度、预培养时间、降温方式、冷冻保护剂对解冻后材料相对存活率存在不同程度的影响,最终筛选出4%蔗糖浓度预培养3天、0℃停留30分钟后直接冷冻、9号保护剂为超低温保存的最佳方案。 选择正常成熟的鱼雷体胚作为试验材料,研究了植株的再生,其萌发率高达90%,萌发后由于新生真叶叶柄嫩、脆,容易导致伤亡,造成成苗率下降。 为了解仙客来体胚发生的调控机制,对体胚发生的蛋白质组进行分析。应用Imagemaster软件分析了体胚(球形胚和鱼雷胚)和对照组(合子胚、萌发胚、非胚性愈伤)的2-DE图谱,分别检测到451、460、360、662、340个蛋白点。通过比较体胚和对照组高丰度的蛋白点,发现在仙客来体胚发生中至少存在35个差异表达的蛋白质。其中5个在球形胚和鱼雷胚中同时出现且稳定表达,13个在鱼雷胚中上调,9个在鱼雷胚中下调,8个是鱼雷胚新出现的蛋白质,推测仙客来体胚的发生和体胚的成熟有特异的蛋白来调控。选择其中12个有代表性的蛋白点(1个稳定表达蛋白、7个上调蛋白、3个下调蛋白、1个新蛋白)胰酶消化后进行MALDI-TOF-MS分析,初步鉴定4个,其余进行MALDI-TOF-TOF-MS分析,初步鉴定6个。 采用蛋白质组学的方法和技术,对仙客来的变异体胚进行了较初步的蛋白质组图谱分析。通过比较正常体胚与变异体胚的蛋白2-DE图谱,发现有6个蛋白点为B型(仅有芽分化)和D型体胚(没有芽和根的分化)缺失的点,而C型(仅有根的分化)存在这6个蛋白点,表明这些蛋白点可能与胚根的分化有关。7个为C型和D型缺失的点,而B型存在,表明这些蛋白可能与胚芽的分化有关系。D型除了缺失上述13个点之外,还缺失3个点,表明这三个点的基因可能同时调控胚根和胚芽的分化。