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引起细胞凋亡的瑞士乳杆菌9的高密度培养研究

廖玲  
【摘要】: 瑞士乳杆菌9(Lactobacillus helveticus 9)筛选于中国新疆传统干酪食品奶疙瘩中,基于体外肠细胞培养模型,当仅仅将瑞士乳杆菌9菌体细胞与酪蛋白在37。C共培养,则获得的细胞水解产物被证实具有良好的调节肠细胞(Caco-2细胞株和IEC-6细胞株)生长的作用;鉴于获得更多酪蛋白水解产物的前提是获得大量的瑞士乳杆菌细胞,本文又进一步开展了瑞士乳杆菌9高密度细胞培养技术研究,旨在为瑞士乳杆菌9的大规模生产应用提供理论基础。主要结果如下: 1、酪蛋白水解产物对Caco-2细胞和IEC-6细胞增殖影响研究表明,瑞士乳杆菌9的酪蛋白水解产物具有一定降低肠细胞增殖与诱导肿瘤细胞凋亡的功效,这样的功效具有剂量效应和纯度效应。6.67mg/mL的F3组分对Caco-2细胞增殖的抑制率达到20.89%,对IEC-6细胞增殖无明显抑制。组分F3-1-1在3.33mg/mL浓度时,对Caco-2细胞增殖抑制率为46.46%,而对IEC-6细胞增殖抑制率仅为9.59%。 2、采用剂量3.33mg/mL的酪蛋白水解产物F3-1-1组分作用于2株肠细胞后,用苏木精-伊红(HE)染色法可以观察到凋亡细胞的核染色质呈现固缩或边集现象,细胞核呈致密浓染,出现了凋亡小体;用吖啶橙/溴化乙锭(AO-EB)染色也可观察到具有染色质固缩的凋亡细胞,但IEC-6细胞株的凋亡效果远不如Caco-2的凋亡效果明显。 3、DNA末端原位标记染色法(TUNNEL)测定结果表明,采用3.33mg/mL剂量的酪蛋白水解产物组分F3-1-1能诱导Caco-2细胞凋亡,凋亡率为14.93%;对LEC-6细胞诱导凋亡效果不明显。 4、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和DNA含量变化研究表明,采用3.33mg/mL剂量的酪蛋白水解产物组分F3-1-1能诱导Caco-2凋亡,在G_0/G_1峰前出现亚二倍体峰,即凋亡峰,凋亡率为31.46%;也可以诱导IEC-6的凋亡,凋亡率为7.9%。显然,瑞士乳杆菌9细胞的酪蛋白水解产物具有抑制肠细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性。 5、瑞士乳杆菌9水解酪蛋白获取生物活性肽的过程中,细胞数量(或接种量)与酪蛋白水解度呈显著相关性。瑞士乳杆菌9的高密度培养受到培养温度、起始pH值、接种量和培养基成分(碳源、氮源、缓冲盐、番茄汁含量)的影响,其适宜的培养条件为:培养温度为37。C,起始pH为6.5,接种量为5%。瑞士乳杆菌9的适宜增殖培养基是脱脂乳10%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白胨1.0%、乙酸钠0.5%和番茄汁18%。 6、基于优化的培养基及合适环境条件,瑞士乳杆菌9在37℃培养10h后,活菌数为1.70×10~9CFU/mL,较对照的活菌数提高了一个数量级;进一步地对瑞士乳杆菌9进行16L发酵罐高密度培养10h后,其活菌数达到3.59×10~9CFU/mL。这些数据对实现瑞士乳杆菌9的大规模培养以及获取乳源活性肽提供了理论和技术支持。


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