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河北杨干旱胁迫响应基因的分离与鉴定

王泽亮  
【摘要】: 河北杨(Populus hopeiensis Hu et Chow)属杨柳科(Salicacae)杨属(Populus L)白杨派(Section Leuce Duby)树种,是一个主要分布在我国西北与华北干旱半干旱地区的重要乡土杨树,它抗旱、抗寒、耐瘠薄、根蘖性强,是进行干旱胁迫相关基因克隆与研究林木干旱胁迫信号转导与耐受性机理的理想材料。本研究以河北杨为试验材料,建立了其组织培养无菌体系,利用cDNA-AFLP差异表达技术对河北杨干旱胁迫响应基因进行筛选,获得了457条TDFs片段。在对其进行分析的基础上,通过同源克隆结合RACE方法从干旱胁迫处理的河北杨中分离了植物CBF/DREB1与DREB2类转录因子基因:PhCBF4a/4b、PhDREB2a/2b,进而对其序列及组织特异性表达模式与不同胁迫条件下的表达模式进行了系统的分析。同时,通过瞬时表达研究与转化拟南芥研究,进一步鉴定了PhCBF4a/4b、PhDREB2a/2b基因的功能。经上述研究主要得到如下结果: 1.以干旱处理不同程度的河北杨无菌生根苗为试验材料,使用256对选择性扩增引物对河北杨干旱胁迫响应基因进行了较为全面的筛选,共回收了484条TDFs片段,最后测序获得457条片段序列。其中,391条TDFs在NCBI蛋白数据库中有同源基因,其余38个在杨树EST数据库中有同源序列,25个在杨树基因组数据库有类似序列,而TDF45-1、TDF183、TDF280-1在三个数据库中均没有类似序列。根据条带强度变化模式,对TDFs条带进行了分级聚类,共分为12个类群,其中Cluster8与Cluster9分别包含118与106条TDFs片段,其表达模式为瞬时上调然后下降或持续上调。这两个类群的TDFs数目占所有片段的49.0%,暗示了这两类基因在河北杨干旱胁迫响应中的重要作用。在所获得的TDFs片段中,有些TDFs片段代表了同一个基因或同一个基因家族的不同成员,也就是说,在干旱胁迫诱导的河北杨中,这些基因的转录本数较多,显示了这些基因在调控河北杨干旱胁迫耐受性中的重要作用。 2.通过同源分析方法,推测杨树CRT/DRE顺式作用元件的核心基序为A/GCCGACA/G,不完全等同于拟南芥CRT/DRE的基序A/GCCGACNT。利用这一推测模式,发现在获得的457条TDFs片段中有8条可能是河北杨DREB转录因子的靶基因。其中有4条是LEA或ERD类的基因,另外4条可能参与了基因转录或翻译过程,而在拟南芥、水稻与玉米中,第二类的基因并没有占如此大的比例,这一结果显示虽然DREB调控子在植物中普遍存在,但并不完全一致。 3.利用同源克隆结合RACE方法从干旱处理的河北杨中克隆了两对DREB类基因:PhCBF4a/4b、PhDREB2a/2b。虽然存在Indel区段与氨基酸残基的替换,但在氨基酸水平上,其序列一致性分别达到94.0%与97.7%,而且其同源基因在其它杨树及杨树杂交群体中的存在模式并不一致,推测它们可能分别是一对等位基因。同时,利用半定量PCR方法对其组织特异性表达模式与不同胁迫条件下的表达模式进行了分析,发现PhCBF4a/4b主要受干旱、低温与NaCl胁迫的诱导,而PhDREB2a/2b基因受干旱、高温与NaCl胁迫条件诱导而较强表达;在各种胁迫条件下,PhDREB2a/2b的表达量基本上均高于PhCBF4a/4b,而且在正常条件下,PhDREB2a/2b也能检测到表达;同时,在各种胁迫条件下,PhCBF4a与4b、PhDREB2a与2b表达模式也并不完全一致。这些结果暗示了PhCBF4a与PhCBF4b、PhDREB2a与PhDREB2b在调控河北杨胁迫抗性中的不同作用。 4.对PhCBF4a/4b同源基因进行的进化发育分析显示,植物CBF/DREB1类基因经历了复杂的进化事件。在从共同的双子叶祖先分离之前或分离过程中,CBF/DREB1基因经历了多次的复制与趋异事件。在双子叶亚家族中,CBF/DREB1基因的分类部分的平行于物种分类,表明部分CBF基因是在物种形成之后才开始进行复制与趋异的进化过程。 5.瞬时表达研究发现PhCBF4a/4b、PhDREB2a/2b具有明显的转录激活功能,而且PhCBF4a与4b、PhDREB2a与2b的转录激活功能有显著的差异,说明其序列的差异导致了其功能的差异,并可能影响到其在河北杨干旱胁迫耐受性中的功能。 6.通过拟南芥遗传转化研究,发现与对照拟南芥植株相比,转PhCBF4a/4b、PhDREB2a/2b基因拟南芥生长迟缓、开花期延迟,在正常条件下,其DREB靶基因的表达量明显提高,干旱胁迫耐受性也明显提高,进一步证实了PhCBF4a/4b、PhDREB2a/2b的转录激活功能及其在调控河北杨胁迫响应中的重要作用。 7.通过重叠PCR方法删除了PhDREB2a/2b 3'编码区的两个PEST序列,瞬时表达研究与转化拟南芥研究证实获得的PhDREB2bP12d基因的转录激活功能并没有提高,初步说明河北杨PhDREB2a/2b可能不存在类似于拟南芥AtDREB2A的翻译后调控过程。 总之,通过研究初步筛选获得了河北杨干旱胁迫响应的TDFs片段,同时分离了河北杨DREB类基因并对它们进行了进一步的分析与功能鉴定,为河北杨及其它杨树干旱胁迫相关基因与干旱胁迫耐受性机理的进一步研究及林木抗旱遗传改良奠定了基础。


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