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蛋白水解物促乳酸菌增殖及高密度培养体系研究

白凤翎  
【摘要】: 由于乳酸菌缺乏各种生物合成途径,不能合成生长必需的一些氨基酸、维生素等物质,营养要求十分苛刻。由于乳酸菌水解蛋白的能力很弱,乳中氨基酸及短肽的含量很低,严格限制乳酸菌在乳中的高密度生长。本研究从乳酸菌营养代谢机制出发,利用大豆蛋白和乳清蛋白水解物对乳酸菌进行增殖研究,探究乳酸菌的营养代谢、生长繁殖、生理生化等与细胞高密度培养的内在联系。利用蛋白水解物促进乳酸菌快速生长,建立高密度细胞培养体系,为提高我国直投式发酵剂的研究水平、促进发酵剂产业发展具有一定的推动作用。 主要研究结果如下: 1.利用碱性蛋白酶水解乳清蛋白和大豆蛋白获得蛋白水解物,水解度分别为16.30%和20.15%。胃蛋白酶水解乳清蛋白-34的最佳工艺条件为pH 2.2,温度60℃,底物浓度2.0%,酶与底物比7.0%,水解度为12.51%。蛋白水解物经超滤、分离获得特征性组分,HPLC和MS分析表明其成分是2-8氨基酸的寡肽和少量氨基酸构成的混合物,氨基酸的构成比例适当,乳酸菌生长必需氨基酸含量较高。凝胶过滤进一步分离乳清蛋白获得二级和三级组分为200D-1500D的短肽混合物。 2.乳培养基中添加大豆蛋白和乳清蛋白水解物对乳酸菌生长具有显著促进作用,对嗜热链球菌作用明显高于保加利亚乳杆菌。单独添加蛋白水解物增殖效果略低于酵母膏,与酵母膏联合使用可使细胞数量提高1.0~1.5个数量级。 3.对嗜酸乳杆菌增殖作用表明乳清蛋白水解物比乳清蛋白、乳清蛋白酸性水解物的效果显著,作用主体物质是分子量小于5kD的分离组分,其中分子量200D-1500D的2-8氨基酸寡肽作用最突出。 4.以1.2%的SPH、0.6%CaCO3、0.5%酵母膏和12%脱脂乳培养可使嗜热链球菌细胞量达到1010数量级,12%脱脂乳、0.5%酵母膏、0.8%SPH和0.6%CaCO3也能使保加利亚乳杆菌的细胞数量达到相同的水平。12%脱脂乳,0.8%酵母膏,0.9%CaCO3和0.9%SPH培养基可使二菌株联合生长达到1011数量级,增殖效果显著。 5.利用化学限定培养基进行乳酸菌生长动力学研究,由必需氨基酸组成的基本培养基只满足乳酸菌生长的最低要求,生长维持一个很低水平。20种全价氨基酸培养基可使保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最大生长速率达到为0.10h-1和0.12h-1。用SPHIV代替全价氨基酸可使细胞密度增加5倍,保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的最大生长速率分别为0.215h-1和0.262h-1,为全价氨基酸的2倍,因此,大豆蛋白水解物可作为氮源补充物促进乳酸菌快速生长。 6.利用蛋白水解物对乳酸菌增殖发酵研究,添加酵母膏脱脂乳培养基的产酸量比脱脂乳增加1倍,添加增殖复合剂后为脱脂乳的3.12倍。添加增殖复合剂可使乳酸菌数量达到1010数量级,比脱脂乳培养基提高10-15倍。从累积添加碱量和单位加碱量两项指标来看,脱脂乳培养基乳酸菌生长呈现缓慢上升曲线,添加酵母膏呈现三段波浪式曲线,添加增殖复合剂为陡峭的上升曲线。单纯添加酵母膏不能支持乳酸菌连续生长,添加大豆蛋白水解物和酵母膏能够使乳酸菌生长快速启动,并维持一个较高生长水平,获得较大的细胞量的同时也充分利用乳中蛋白质。


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