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同位素稀释液相色谱质谱法测定血清总胆固醇和甘油三酯

周伟燕  
【摘要】:血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)是临床实验室重要的常规测定项目,其水平的高低不仅用于高脂血症的诊断,而且在心血管防治中具有重要意义。胆固醇在体内主要有两种存在形式:游离胆固醇和胆固醇酯,两种物质都是脂溶性化合物,在血中以脂蛋白的形式存在。血清胆固醇检测即测定血清TC。TG是血清总甘油(TTG)的主要组成物质,约占90-95%,其次是游离甘油(FG)及少量甘油酯,一般认为血清总甘油和游离甘油之差为TG。临床检验有时测定真正甘油三酯,但更多的情况是测定总甘油。TC和TG的常规测定方法大多是酶法,方法简单、快速、方便、易自动化,可实现临床大批量样本的快速检测需求。TC和TG的常规方法虽有诸多优点,但需要建立可靠的参考方法实现其测定的标准化,从而使这些常规方法有源可溯,实现常规测定的准确、可比。 同位素稀释质谱(ID-MS)是国际公认的一级测量原理。其可靠性来源于质谱分析的高度特异性和同位素稀释的高度精密性。由于同位素内标与被测物有相同或非常接近的理化性质和行为,内标与被测物一旦充分混合,两者的比值基本不受其他因素的影响。因此同位素内标稀释分析是内标法定量的理想情况,精密度高,准确性好。同位素内标和质谱检测器的使用是分析准确性和可靠性的保证。因此,ID-MS原理被广泛用于临床化学参考测量。本研究采用ID-MS原理建立血清TC. TTG、FG的准确测定方法。 本研究采用胆固醇水溶液作校准溶液,[3.4-13C2]-胆固醇作内标,用氢氧化钾醇溶液水解血清胆固醇酯为胆固醇,用三氧化铬-硫酸氧化胆固醇为胆甾-4-烯-3,6-二酮,用液相色谱质谱(LC/MS)或液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)分析胆固醇和内标氧化产物,采用大气压化学电离源的正离子模式进行检测,用二元回归模型进行定量,建立了同位素稀释液相色谱质谱(ID-LC/MS)和同位素稀释液相色谱串联质谱(ID-LC/MS/MS)原理测定血清总胆固醇的方法。方法测定单个血清的相对扩展不确定度为0.7%左右。 本研究采用甘油水溶液作校准溶液,[13C3]-甘油作内标,用氢氧化钾乙醇溶液水解血清甘油酯为游离甘油,用酸性乙醇沉淀蛋白,用苯甲酰氯将甘油衍生,质谱检测采用电喷雾离子源正离子扫描模式和多反应监测(MRM)的检测方式,建立了ID-LC/MS/MS原理测定血清总甘油的方法。方法测定单个血清总甘油的相对扩展不确定度为1%左右。利用相似的原理建立了ID-LC/MS/MS测定血清游离甘油的方法。所建方法同HPLC法测定血清游离甘油的平均相对偏差为-0.11%。 本研究对血清TC和TG测定的样品前处理、校准溶液、内标、色谱质谱条件、定量方法等过程进行了详细的研究,在国内首次使用同位素稀释液相色谱串联质谱原理建立了血清TC、TTG和FG的准确测定方法。各方法测定有证参考物质的结果均在认定值的不确定度范围内,参加IFCC组织的国际参考方法比对的结果均与参加各国达到等效一致。方法简单、快速、准确、精密,可望用作血清胆固醇、总甘油测定的参考方法。研究还根据此方法建立了我国血清胆固醇和总甘油测定的候选参考测量程序。目前,以上建立的方法已应用到临床血脂检测标准化计划之中,并取得很好的结果。


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