氨基糖苷类抗生素对重组钝化酶的稳定性及耐药分子机理研究

【摘要】：氨基糖苷类抗生素是临床治疗感染的主要抗菌药物之一,进入临床使用已有60多年的历史,在这个过程中细菌也不断进化,产生了强大的耐药机制抵御抗菌药物的选择。细菌对氨基糖类抗生素的耐药机制有四种分别是：(1)产氨基糖苷类修饰酶(AMEs)。包括三个大的家族乙酰化酶(AAC)、磷酸化酶(APH)和腺苷化酶(ANT);(2)产16s rRNA甲基化酶;(3)细菌细胞外膜通透性改变;(4)外排泵对药物的外排作用。其中氨基糖苷类修饰酶和16s rRNA甲基化酶是最主要的耐药机制。前者修饰氨基糖苷类抗生素侧链上的氨基和羟基,后者甲基化修饰氨基糖苷类抗生素的作用靶点16s rRNA,两种机制都可以有效的阻断氨基糖苷类抗生素与靶点结合,从而使其失去抗菌活性。 本论文研究氨基糖苷类抗生素对三类重组氨基糖苷类修饰酶的稳定性,研究临床重要耐药菌——鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药的分子机制,旨在探讨基于氨基糖苷类钝化酶(AMEs)、16s rRNA甲基化酶的氨基糖苷类抗生素耐药分子机制研究,为氨基糖苷类抗生素的结构改造提供依据,为临床抗感染治疗提供有效药物。 论文第一部分在前期工作基础上,应用分子生物学、基因工程技术,获得三类、6个重组细菌氨基糖苷类修饰酶,建立了氨基糖苷类抗生素分子评价模型和方法,并评价了8个主要的氨基糖苷类抗生素即威替米星(1-N-乙基威大霉素)、威大霉素、奈替米星(1-N-乙基西索米星)、西索霉素、依替米星(1-N-乙基庆大霉素Cla)、庆大霉素、阿米卡星(1-N-氨基-羟丁酰卡那霉素A)、卡那霉素对常见的三类重组氨基糖苷类钝化酶即乙酰化酶AAC(6')-Ⅰe、AAC(6')-Ib、AAC(6')-Ib-cr、磷酸化酶APH(2")-Ⅰa、双功能修饰酶AAC(6')-Ⅰe-APH(2")-Ⅰa、腺苷化酶ANT(2")-Ⅰa的稳定性,比较不同的酶之间的催化活性的差异,以及同一个酶对不同底物,尤其对半合成抗生素与其母体化合物之间的催化活性的差异。 结果表明,双功能酶AAC(6')-Ⅰe-APH(2")-Ⅰa乙酰化结构域对底物的转化效率最强,kcat/Km值在105-107M-1S-1。乙酰化酶AAC(6’)-Ie对底物的转化效率在103-105M-1S-1。AAC(6')-Ⅰb, AAC(6')-Ⅰb-cr, APH(2")-Ⅰa, AAC(6')-Ⅰe-APH(2")-Ⅰa磷酸化结构域和ANT(2”)-Ia对底物的转化效率均介于104-105M-1S-1。总体上,8个氨基糖苷类抗生素对重组乙酰化酶、磷酸化酶、腺苷化酶的稳定性,以阿米卡星、威替米星最强,其次为奈替米星、依替米星,半合成抗生素威替米星、奈替米星、依替米星、阿米卡星分别高于其母体化合物威大霉素、西索霉素、庆大霉素、卡那霉素。 威替米星对乙酰化酶AAC(6’)-Ⅰe的稳定性明显优于其他抗生素优势。比母体化合物威大霉素稳定45.8倍,比其它六个药物稳定69.1-250倍。威替米星对双功能酶AAC(6')-Ⅰe-APH(2")-Ⅰa乙酰化结构域的稳定性比母体化合物威大霉素强39.2倍,比其它六个化合物强60.0-116.7倍。威替米星对腺苷化酶ANT(2”)-Ⅰa的稳定性。也表现出了优势(阿米卡星不与其反应除外),比其它化合物稳定1.8-7.5倍。磷酸化酶APH(2”)-Ⅰa以及AAC(6')-Ⅰe-APH(2")-Ⅰa的磷酸化结构域对8个药物的磷酸化作用,以及乙酰化酶AAC(6')-Ⅰb及AAC(6')-Ⅰb-cr对8个药物的乙酰化作用的催化参数在相对较小的范围内波动。 阿米卡星对磷酸化酶APH(2")-Ⅰa,双功能酶AAC(6')-Ⅰe-APH(2")-Ⅰa磷酸化活性,乙酰化酶AAC(6')-Ⅰb及AAC(6')-Ⅰb-cr乙酰化活性以及以及腺苷化酶ANT(2”)-Ⅰa腺苷化活性均显示出了比其它药物强大的稳定性。这可能是因为其结构中2脱氧链霉胺环上的1-N-氨基羟丁酰取代基能显著影响这些酶与底物的结合的空间位阻,并降低酶对底物的转化效率。 论文第二部分研究临床重要耐药菌——鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药的分子机制,考察了13种常见的修饰酶基因型及3种常见的甲基化酶基因型在52株氨基糖苷类抗生素高水平耐药(庆大霉素、阿米卡星MIC1024μg/mL)的鲍曼不动杆菌中的分布。 结果表明,52株高水平耐庆大霉素和阿米卡星的菌株中,乙酰化酶基因是所有修饰酶基因型中检出率最高的基因,aac(3)-Ⅰ和aac(6’)-Ⅰb的检出率分别为71.1%(37/52)和57.6%(30/52),腺苷化酶基因ant(2”)-Ⅰa和ant(3”)-Ⅰa的检出率次之,分别为53.8%(28/52)和5.7%(3/52),磷酸化酶基因aph(3’)-Ⅲa、aph(2”)-Ⅰb、aph(2”)-Ⅰc、aph(2”)-Ⅰd、aph(4”)-Ⅰa和腺苷化酶基因ant(4’)-Ⅰa均未检出。3个16srRNA甲基化酶基因中,armA基因的检出率最高,达98%(51/52),rmtB,rmtC基因未检出。鲍曼不动杆菌中同时检出三个不同的耐药基因的概率高达69.2%(36/52)。构建基因组文库筛选携带耐药基因转化子的结果表明,armA基因是介导临床分离鲍曼不动杆菌高水平耐庆大霉素和阿米卡星的基因,威替米星与其它氨基糖苷类抗生素相比,对16s rRNA甲基化酶的修饰作用没有优势。