喉鳞癌相关蛋白质组学研究及肿瘤标志物的鉴定

【摘要】：[背景与目的]喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,在头颈部恶性肿瘤中发病率仅次于鼻咽癌居第二位,占20%左右；喉癌90%以上为鳞状细胞癌。早期喉癌治疗效果较好,喉功能可得以保留,5年生存率可达80-95%；晚期喉癌由于浸润和转移,治疗效果差,5年生存率在60%以下。临床上约40%喉癌为Ⅲ-Ⅳ期的晚期患者。因此,喉癌治疗的关键在于有效的早期诊断,而喉癌中尤其以声门上型和声门下型喉癌早期诊断困难,临床上亟待寻找相关的肿瘤标志物以辅助早期诊断。 [方法]收集喉鳞状细胞癌患者的手术切除新鲜肿瘤组织和对应的正常喉粘膜组织进行体外原代培养,收获其条件培养基。条件培养基所含总蛋白以10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,随后进行质谱分析,以此构建喉鳞癌相关游离蛋白数据库,并对数据库中的蛋白利用BinGo系统进行生物信息学分析。继而,从上述喉鳞癌相关蛋白数据库中选取KLK6、DJ-1、14-3-3sigma三个蛋白,在肿瘤组织和外周血样品中进行验证。通过酶联免疫吸附分析方法测定喉鳞癌患者、头颈部良性肿瘤及正常健康人血浆KLK6蛋白水平,分析各组之间及手术前后血浆中KLK6蛋白浓度变化；采用免疫组织化学染色的方法,观察KLK6、DJ-1、14-3-3sigma蛋白在喉鳞癌组织及正常喉粘膜上皮中表达变化,并分析三种蛋白表达变化与临床病理因素的关系。 [结果]在原代组织培养的条件培养基中共鉴定出982个蛋白质,其中在正常喉粘膜组织条件培养基中鉴定出的蛋白为213个,在喉鳞癌组织中鉴定出的特异蛋白为48个。通过对蛋白数据库进行生物信息学分析发现：条件培养基蛋白参与了蛋白水解、糖代谢、免疫反应、应激反应等重要细胞功能过程。对差异蛋白进行聚类分析表明,在正常喉粘膜组织条件培养基中鉴定出的蛋白主要参与免疫防御以及细胞骨架相关的生物学过程,在喉鳞癌组织条件培养基中鉴定出的蛋白则主要以正向调节上皮细胞增殖、细胞粘附及疾病相关的生物学过程。酶联免疫吸附实验结果显示：喉鳞癌患者血浆KLK6的浓度明显高于头颈部良性肿瘤组和健康对照组(P0.001)；喉鳞癌患者手术前后血浆KLK6蛋白浓度差异有统计学意义(P0.001)；伴有淋巴结转移的喉鳞癌患者血浆KLK6蛋白浓度高于无淋巴结转移者(P0.05)。免疫组织化学染色结果表明：在喉鳞癌组织中,KLK6蛋白阳性表达率明显高于正常喉粘膜组织(P0.001)；DJ-1蛋白阳性表达率显著高于正常喉粘膜组织(P0.001)；14-3-3sigma蛋白阳性表达率显著低于正常喉粘膜组织,两组之间差异显著(P0.001)。 [结论]体外培养喉鳞癌组织并进行蛋白质组学分析是一种新的标志物筛选方法。此培养体系为寻找血液中新的喉鳞状细胞癌相关分子标志物、为辅助喉鳞癌诊断和指导治疗提供了新的线索。KLK6、DJ-1、14-3-3sigma蛋白在喉鳞癌发生发展过程中可能发挥重要作用。