P38 MAPK参与调节人脐带间充质干细胞对人白血病肿瘤细胞的生长抑制

【摘要】：目的：间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSC)是一类塑料贴壁生长、具有一定表面分子特征和多向分化能力的成体非造血干细胞。MSC可以由骨髓、脐带、胎盘、脂肪等多种组织中分离获得。研究报道MSC具有造血支持、免疫调节、修复损伤组织等多种功能。由于MSC具有免疫原性较低、方便携带基因且可被募集到炎症及损伤部位等多种特性,MSC被当作是组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。此外,研究表明间充质干细胞对许多免疫细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞都具有增殖抑制效应,而且该效应是通过周期阻滞,而不是诱导凋亡来实现的。最近研究报道骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BM-MSC)对造血系统及非造血系统来源的肿瘤细胞都有较强的增殖抑制作用。细胞间接触和可溶性细胞因子被证明参与了MSC对肿瘤细胞的体外增殖抑制效应,但有关该效应中的信号通路研究较少。P38 MAPK信号通路被广泛证实参与调节细胞增殖与肿瘤生成。有文献报道p38 MAPK甚至参与细胞周期阻滞和cyclinD表达水平的下调。人脐带来源的MSC (Human umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC)相对于骨髓来源的MSC具有来源广泛、取材创伤性小、伦理争议少、细胞增殖能力强等多种优点。本文研究了UC-MSC对人白血病肿瘤细胞的增殖抑制效应及p38 MAPK信号通路在其中的作用。 方法：本实验用Brdu掺入的方法检测了UC-MSC对白血病肿瘤细胞增殖能力的影响；用流式PI掺入的方法检测了与UC-MSC共培养的白血病肿瘤细胞的周期分布；用流式Annex in V与PI共染色的方法检测了与UC-MSC共培养的白血病肿瘤细胞的调亡水平；用Western blot的方法检测了UC-MSC对白血病肿瘤细胞内p38 MAPK信号通路的激活情况。信号通路常用阻断方法来分析。用P38 MAPK信号通路的特异性激酶抑制剂SB203580来验证p38 MAPK信号通路在MSC介导的增殖抑制中所起的作用。由于信号通路抑制剂常常有非特异性抑制效果,本研究使用了p38MAPK的特异性小干扰RNA (siRNA)来降低p38 MAPK的表达水平,并检测其生物学效应。此外还用Western blot检测了p38 MAPK在MSC调节白血病肿瘤细胞的细胞周期蛋白中所起的作用。 结果：UC-MSC对HL60、K562细胞的增殖有很强的抑制作用,且呈剂量依赖性,共培养组在UC-MSC与肿瘤细胞细胞数相同时抑制效应最明显。UC-MSC对低血清诱导的HL60、K562细胞凋亡具有保护作用。UC-MSC阻滞HL60、K562细胞的细胞周期于G0/G1期。UC-MSC增加了HL60、K562细胞内p38 MAPK的磷酸化水平,且呈时间依赖性,在UC-MSC处理后20分磷酸化水平达到峰值。特异性的药物抑制p38 MAPK通路或特异性的小干扰p38 MAPK的表达水平都部分削弱了UC-MSC对HL60、K562细胞的增殖抑制及周期阻滞效应。UC-MSC介导HL60、K562细胞内细胞周期调节蛋白的表达水平变化,而SB203580逆转了这一效应。 结论：研究表明UC-MSC具有抑制白血病肿瘤细胞增殖的生物学作用。这种增殖抑制是通过G0/G1期周期阻滞而不是诱导凋亡而实现的。UC-MSC处理活化了肿瘤细胞中的p38 MAPK信号通路。p38MAPK信号通路参与UC-MSC对白血病肿瘤细胞的增殖抑制、周期阻滞及细胞周期蛋白的调节,是其中发挥重要作用的信号通路之一。间充质干细胞可以被肿瘤细胞募集后诱导分化为肿瘤相关性成纤维细胞,参与构建肿瘤微环境。我们研究中发现的间充质干细胞对白血病肿瘤细胞的增殖控制及G0/G1期周期阻滞效应与造血干细胞龛对造血干细胞维持其静息状态的情况类似。而造血干细胞龛的研究比较深入,已经报道了许多相关的可溶性因子、细胞受体及胞内信号通路,或许有一部分机制同样适用于解释间充质干细胞与肿瘤细胞之间的关系。我们的实验仅就间充质干细胞影响肿瘤细胞的胞内信号进行了研究,其细胞外活化信号仍有待于进一步研究。 目的：人间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞,常见于骨髓、脐带、脂肪、胎盘等多种组织来源。研究表明间充质干细胞具有造血支持、免疫调节、组织修复等多种功能。近年来有报道间充质干细胞通过被募集到损伤部位、分泌促血管生成细胞因子、甚至分化为内皮细胞等多种途径参与血管新生。而内皮细胞本身可以通过活化、迁移、增殖等形成血管及血管网。本课题欲初步探讨人脐带间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞对血管新生的影响机制。 方法：采用组织剪碎、胶原酶、胰酶消化、贴壁培养人脐带间充质干细胞,并进行形态分析、表型鉴定、多向分化潜能鉴定。采用胶原酶消化、贴壁培养人脐静脉内皮细胞,并进行形态分析、表型鉴定、低密度脂蛋白摄取实验鉴定。两种细胞均进行Matrigel体外管状物形成实验。 结果：人脐带间充质干细胞体外梭形贴壁生长,β-tubulin表达量高,表型鉴定CD29 CD90、CD105、CD73、CD44、CD166、HLA-ABC阳性,CD34、CD45、CD133、CD31、CD146、HLA-DR阴性,表达高水平的Nanog、Oct-4、Sox-2。间充质干细胞体外诱导成骨成脂染色阳性。人脐静脉内皮细胞体外梭形贴壁生长,β-tubulin表达量高,表型鉴定CD29、CD105、CD31、CD146、CD44、CD73、CD166、HLA-ABC阳性,CD34、CD45、CD133、CD90、Nanog、Oct-4、Sox-2、HLA-DR阴性。内皮细胞低密度脂蛋白摄取试验阳性。在血管内皮生长因子的刺激下,未分化的人脐带间充质干细胞体外具有Matrigel管状物形成能力,与内皮细胞相似。结论：人脐带间充质细胞与人脐静脉内皮细胞均具有发达的微管系统及类似的粘附分子,提示二者均具有较强的细胞变形能力及迁移能力。二者均不表达造血细胞标志。HLA-DR表达水平低提示二者免疫原性都较低,可作为组织工程的种子细胞。二者表达类似的基质细胞标志但人脐带间充质干细胞表达高水平干细胞标记分子Nanog、Oct4、Sox2,而人脐静脉内皮细胞则表达晚期分化的内皮细胞标志CD31,提示人脐带间充质干细胞具有一定的自我更新、多向分化的干细胞特性,而人脐静脉内皮细胞则为分化较成熟的内皮细胞。在血管内皮生长因子的刺激下未分化的人脐带间充质干细胞具有类似内皮细胞的体外基质胶成管状物能力。提示人脐带间充质细胞与内皮细胞可能均可用于组织工程中的血管新生。