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银杏和木兰属植物的转录组、叶绿体基因组及其相关研究

林小涵  
【摘要】:随着国内外药材市场需求量不断增加,生态环境受到严重破坏,中药资源长期无序开发,濒危野生药用植物物种数量也随之快速增加。将分子生物学应用于药用植物的现代化研究中,可以科学地解决这些问题,从而促进药用植物领域的可持续发展。揭示药用植物天然活性成分生物合成途径,实现其关键酶基因的克隆与体外高效表达,结合代谢工程大规模生产药用植物的有效成分将成为药用植物转录组学的良好应用前景。快速高效获得叶绿体基因组序列的方法的突破,将加速叶绿体基因组研究的速度。基于叶绿体基因组序列对药用植物的鉴定,结合叶绿体基因工程提高濒危药用植物次生代谢产物含量的研究将有利于道地药材的基原植物的鉴定、栽培品种的选育、及中药资源的保护利用。本课题采用目前最新的二代测序技术,结合银杏、木兰属的研究现状,分别从转录组分析、药用天然产物生物合成途径、关键酶基因克隆、叶绿体基因组分析等方面,有针对性地进行深入研究。本文的研究内容主要包括了以下几个方面: (1)为了有效发现有着“活化石”之称的药用植物银杏的功能基因并了解其发育和抗性相关机制,本研究基于新一代Roche 454 GS FLX高通量测序技术,从银杏叶片的cDNA文库中获得了64057ESTs,将其与GenBank已登录的21590条银杏的ESTs共同拼接组成了22304个unigene。其中13922个unigene为本研究测序最新发现。获得可能参与银杏萜内酯生物合成的26个unigene(编码14个关键酶),参与银杏黄酮合成的78个unigene(编码10个关键酶),发现了多个编码与抗病与防御相关的unigene o本研究克隆了3个编码银杏萜内酯和银杏黄酮合成的关键酶基因GbIDS、GbPAL、GbCHS全长,表明高通量测序技术在基因发现的水平上优于传统测序方法。此外,通过数据分析,本研究共发现204个EST-SSRs.我们的研究不仅为基于转录组研究的生物合成机制的研究奠定了基础,同时也为非模式植物的功能基因组学与发育机制的研究提供了一个很好的研究方向,。 (2)叶绿体基因组序列通常用于物种进化分析、物种鉴定和叶绿体基因工程等方面的研究。但由于叶绿体DNA (cpDNA)提纯技术不够成熟,加之其测序费用高昂,使得已测叶绿体基因组的物种数量还很有限。叶绿体基因工程的发展处于一个瓶颈期,主要是由于大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。而叶绿体基因组序列的增加将有效解决上述问题。本研究针对以上问题,对前人的叶绿体提取方法进行改进与优化,结合新一代Roche 454 GS FLX测序技术和MID标签技术,建立了快速获得叶绿体全基因组序列的方法。该方法突破了以往叶绿体基因组研究中难以快速获得cpDNA序列这一技术障碍。本研究采用以上方法报道了银杏叶绿体基因组的全长序列,并与已报道的其它裸子植物进行叶绿体序列特征比较分析。银杏叶绿体基因组序列全长为156982 bp,其中LSC区、SSC区及IR区的长度分别为99251 bp、22267 bp、17732 bp。共含有139个基因,其中包含43个tRNA基因,8个rRNA基因和6个ycf基因。序列分析结合验证实验证明了ycf2基因所在的位置为LSC区,而非原有报道中IR区。在银杏叶绿体基因组内部发现了10个稳定的intraSNPs,20个序列长度大于等于30 bp的cpSSRs,为揭示银杏的叶绿体发育分子机制及进化历程提供了分子依据。同时cpSSR引物的开发可能有利于银杏不同居群的鉴定。本研究对木兰科木兰属的5个物种9个样品进行叶绿体全基因组测序,初步证明叶绿体全基因组在物种种下居群的鉴定效果优于单个基因的物种鉴定能力。这5个物种9个样品的cpDNA中发现的cpSSRs,将有利于新型标记的开发。CpSSRs分布特点和规律的研究将有助于我们加深对cpDNA进化的认识。大量叶绿体基因组序列的快速获得,为药用植物的叶绿体基因工程的实现、物种鉴定及进化的研究提供了良好的遗传背景,为今后药用植物产量、品质改良、生物制药等众多领域研究开创了新的机会。 (3)相比于目前唯一的叶绿体注释网站DOGMA,我们构建了CpGAVES网站(网址为:http://CpGAVES-plantidit.dnsalias.org),为叶绿体基因组的研究者提供了注释、画图、在线编辑、产生上传GenBank的文件一体的服务。CpGAVES的输入文件为完整的叶绿体基因组序列。第一步,对该序列蛋白质编码序列及外显子和内含子结构进行精确预测;第二步,使用tRNAscan-SE和vmatch软件进行tRNA基因和IR区的预测;第三步,注释结果以环形图形显示,包括物种名称、基因定位和方向、各个特征序列的长度。用户可以在线增加、减少或者编辑基因特性,并且可以下载注释结果的GFF3格式以便使用第三方软件进行数据分析,也直接保存环形的注释图的JPEG格式以供文章发表使用。最后,CpGAVES可能够创建用于上传GenBank的Sequin文件。CpGAVES极大地方便了叶绿体研究者对数据的处理,同时也提高了叶绿体基因组分析的效率。


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