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异黄酮对血管内皮功能的改善作用及对microRNA-424促动脉粥样硬化抑制作用的研究

李少华  
【摘要】:研究背景 冠心病是影响人类健康的一种重要疾病,内皮功能障碍是动脉粥样硬化和冠心病发生发展的早期特征。研究显示,雌激素通过介导的一氧化氮合酶的激活以及促进一氧化氮生成并释放,可以发挥内皮保护作用。绝经后的妇女卵巢功能减退、雌激素分泌减少。雌激素缺乏使绝经后的妇女处于患心血管疾病的高危风险状态中。有报道显示,绝经后妇女患冠心病的风险是同龄男性的三倍。异黄酮是来源于大豆的一种植物类雌激素。动物试验证实,皮下注射异黄酮4周,可以观察到卵巢切除的小鼠内皮一氧化氮合酶活性增加,并可逆转起初的内皮功能障碍。因此,异黄酮作为一雌激素的替代物,应用于绝经后的妇女,则可能会使其发挥雌激素的作用,保护甚至改善绝经后妇女的血管内皮功能,减少绝经后妇女发生心血管疾病的风险。 但是,临床试验的结果却不一致。2002年,van der Schouw等人对403名绝经后妇女研究显示,日常摄入异黄酮与主动脉僵硬度不存在相关性,但是随后的人体试验却显示动脉内注射异黄酮后可以观察到血管舒张反应以及血流的增加。随机双盲对照试验的结果也不尽相同。一些随机对双盲试验支持异黄酮可以显著改善绝经后妇女血管的内皮功能,而其它一些设计相似的试验却得出了相反的结论,即异黄酮不能改善绝经后妇女的内皮功能。因此,异黄酮在绝经后妇女体内是否确实可以改善血管的内皮功能,其影响因素有哪些,谁是主要因素,是目前迫切需要解决的问题。 研究目的 对绝经后的妇女口服异黄酮改善血管内皮功能的效果进行一项临床荟萃分析,探索其中的影响因素,找出影响异黄酮改善绝经后妇女内皮功能的主要因素,为异黄酮在临床上的合理应用提供依据。 研究方法 内皮功能的改善与否,以应用异黄酮后肱动脉血流介导的血管扩张(flow-mediated dilation, FMD)由基础到终点的变化值为标志。通过检索PubMed、Embase、Cochrane数据库,入选2009年3月以前在公开刊物上发表的随机、双盲、安慰剂对照的临床试验作为荟萃分析的数据来源。荟萃分析采用随机效应模型,计算各个研究的加权平均值(WMD)及95%的可信区间。同时,应用Meta回归分析及亚组分析来寻找异质性的主要来源。 研究结果 荟萃分析显示,9个试验,口服异黄酮可以显著改善内皮功能(WMD:1.75%; 95%CI:0.83,2.67; P=0.0002).但是,结果存在显著的异质性(异质性x2101.83,I2=92%,P0.00001)。我们应用Meta回归以及亚组分析来探索异质性的来源。Meta回归分析显示,年龄校正的基础FMD值是主要异质性的来源(回归系数:-0.22,P=0.036),而研究对象的年龄(57岁至66.7岁)、异黄酮的来源、服用剂量(50 mg/天-99 mg/天)、服用时程(2周至12个月)以及受试者血脂水平(180 mg/dL-286 mg/dL),均不是结果异质性的主要来源。亚组分析结果进一步显示,按照受试者年龄中值(59岁)、异黄酮的来源(大豆或其他来源)、异黄酮口服剂量中值(80 mg/天)、服用时程中值(8周)、受试者血总胆固醇水平中值(228 mg/dL)为界限分亚组,亚组间无统计学差异。而年龄校正的基础FMD值5.2%亚组,异黄酮可以显著改善绝经后妇女血管的内皮功能(WMD: 2.22%; 95%CI:1.15,3.30; P 0.0001),而年龄校正的基础FMD值≥5.2%亚组,异黄酮不能显著改善血管的内皮功能(WMD:0.24%; 95%CI:20.94,1.42; P=0.69),两亚组结果间的差异具有统计学意义(P=0.001)。同时,基础FMD值≥5.2%亚组异质性消失,(异质性x2=0.73,I2=0%,P=0.87)。 结论 荟萃分析结果显示,异黄酮对绝经后妇女血管内皮功能的改善取决于内皮的基础状态。若服用异黄酮之前,绝经妇女血管内皮功能(FMD值)低于5.2%,则服用异黄酮后妇女的血管内皮功能可以得到显著的改善;若绝经妇女基础内皮功能(FMD值)较高,大于等于5.2%,即内皮功能尚好,则服用异黄酮后内皮功能改善效果不明显。 研究背景 动脉粥样硬化导致的冠心病是由血管局部以及全身的炎症反应所引起。内皮细胞的受损、单核细胞及粒细胞的激活、相关细胞因子和黏附分子的产生、白细胞的黏附和浸润、单核细胞浸润后向巨噬细胞的分化和激活、泡沫细胞的形成、平滑肌的迁移等,最终导致脂质的沉积和粥样斑块的形成。 表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多,已知的有DNA甲基化(DNAmethylation),基因沉默(gene silencing)和RNA编辑(RNA editing)等。MicroRNA是一类长度大约为22个核苷酸的非编码单链小RNA,在进化上具有高度的保守性。microRNA通过与靶mRNA3'端非翻译区(3'UTR)互补结合,在转录后水平抑制靶基因的表达或直接降解靶mRNA,在生物体的物质代谢、细胞周期调控、细胞分化与凋亡、发育等一系列生命活动中发挥重要作用。 最近在免疫炎症研究中发现,体外培养的单核细胞在向巨噬细胞分化过程中,有miR-424的参与。miR-424的增加进而可以抑制转录因子NFI-A的翻译过程,从而使NFI-A产生减少。NFI-A在单核细胞分化为巨噬细胞的过程中起抑制作用,它的减少意味着单核细胞向巨噬细胞分化的趋势的增加。动脉粥样硬化也是一种局部和全身性炎症反应,同样也存在单核-巨噬细胞这一分化过程。因此,具有全身性炎症反应特征的冠心病患者,其外周血中的单核细胞,必然已经具备了向巨噬细胞分化的物质基础,这其中可能就有miR-424的参与和表达水平的改变。 大豆异黄酮已经证实其不仅仅具有促进内皮细胞生成一氧化氮、改善内皮功能的作用,而且具有抑制炎症因子产生等抗炎和抗动脉粥样硬化作用。异黄酮抑制炎症因子产生有如下证据:(1)在单核-巨噬细胞系培养过程中中加入不同浓度的异黄酮预处理,结果巨噬细胞分泌的TNF-a浓度显著减低,而且减低的程度与预加入的异黄酮浓度呈剂量依赖性;(2)异黄酮的主要成分genistein可以显著抑制免疫反应中脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)刺激的单核细胞IL-6 mRNA的表达以及IL-6的生成。但上述实验研究仅仅发现了异黄酮能够抑制]fNF-a和IL-6的产生,但是对于其中的机制,尚未有合理的解释。我们知道,TNF-α、IL-6都是巨噬细胞活化后分泌的主要炎症因子,这些炎症因子进一步促进了动脉粥样硬化的发生发展。而我们本实验若证实在冠心病患者体内的动脉粥样硬化发展中,miR-424是单核-巨噬细胞分化过程中的关键microRNA,而异黄酮就可能通过一定的机制抑制了miR-424在单核细胞中的表达,从而抑制了单核细胞向巨噬细胞的分化,进而使活化的巨噬细胞减少,最终导致巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6减少。 本研究从体内体外两方面着手,体内研究着重验证miR-424及其靶蛋白NFI-A是否参与了动脉粥样硬化的发生发展,而体外研究着重探索异黄酮是否可以干扰或抑制体外培养的单核细胞miR-424的表达。 研究目的 体内研究的主要目的为在冠心病患者中,验证miR-424及其靶蛋白NFI-A是否参与了动脉粥样硬化的发生发展,而体外研究的目的是观察异黄酮是否可以干扰或抑制体外培养的单核细胞miR-424的表达。 研究方法 体内试验,收集并分离得到受试者外周血单核细胞,应用microRNA分离提取试剂盒得到总的microRNA,在对miR-424及内参U6进行逆转录及实时定量PCR,测得miR-424的相对表达量,应用Western blot检测miR-424的靶蛋白NFI-A的表达量,ELISA法测定受试者血浆中IL-6、TNF-α的浓度。 体外实验,分离得到健康成年人外周血单核细胞,加入异黄酮等干预因素后体外培养24小时,然后应用microRNA分离提取试剂盒得到总的nicroRNA,在对miR-424及内参U6进行逆转录及实时定量PCR,测得miR-424的相对表达量,ELISA法测定受试者血浆中IL-6、TNF-α的浓度。 研究结果 一、对照组、不稳定性心绞痛组及心肌梗死组三组之间临床基线资料比较 三组受试者年龄、性别组成之间无统计学差异。体格检查中,三组之间在身高、体重、体重指数、收缩压、舒张压方面无显著的统计学差异。受试者常规进行血液生化分析显示外周血中单核细胞数目、血浆中的空腹血糖水平、肌酐、尿素氮水平,以及甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、CK-MB水平这些检测指标三组间无显著统计学差异。与对照组相比,不稳定性心绞痛组及心肌梗死组高敏C反应蛋白水平显著升高(P0.001),而与不稳定性心绞痛组相比,心肌梗死组的高敏C反应蛋白水平也有显著升高(P0.01)。三组间他汀类的用药比例进行了卡方检验,P值为0.204,无统计学差异。 二、三组间单核细胞表达miR-424的比较 与对照组比较,不稳定性心绞痛组miR-424相对表达水平为1.38±0.33倍(P0.05),而心肌梗死组miR-424相对表达水平更高,达到3.69±0.92倍,与对照组相比升高了近4倍(P0.001),与不稳定性心绞痛组相比,升高了也近3倍(P0.01)。 三、三组间单核细胞表达德miR-424靶蛋白NFI-A含量比较 与对照组相比,不稳定性心绞痛组和心肌梗死组患者单核细胞中NFI-A蛋白的表达量显著减低(不稳定性心绞痛组,P0.01:心肌梗死组,P0.001)。心肌梗死组与不稳定性心绞痛组相比,减低的程度也有显著统计学意义(P0.01)。 四、miR-424表达水平与各临床指标的相关性分析 为探讨影响三组间miR-424表达水平差异的主要因素,我们随后进行了Pearson相关性分析,以分析miR-424表达水平与与受试者年龄、BMI、收缩压、舒张压、外周血单核细胞数、血浆空腹血糖水平、甘油三酯、低密度脂蛋白、CK-MB以及高敏C反应蛋白的相关性。分析结果显示,miR-424表达水平与高敏C反应蛋白最为相关(r=0.553,P0.001),其次与外周血单核细胞数相关(r=0.277,P=0.026),再次与低密度脂蛋白相关(r=0.258,P=0.035)。miR-424表达水平与其它因素不存在统计学相关性。 五、血浆中炎症因子IL-6、TNF-α测定 IL-6和TNF-α是巨噬细胞分泌的两种主要的炎症因子,在动脉粥样硬化的病理生理过程中发挥有重要作用。我们应用ELISA试剂盒检测了本研究受试者血浆中IL-6和TNF-a的浓度,结果显示,与对照组相比,不稳定性心绞痛组和心肌梗死组患者血浆IL-6(不稳定性心绞痛组:5.66±1.64 pg/ml vs 1.52±0.40 pg/ml,P0.01;心肌梗死组:11.74±1.36 pg/ml vs 1.52±0.40 pg/ml, P0.001)和TNF-a(不稳定性心绞痛组:64.34±11.54 pg/ml vs 29.07±6.12 pg/ml, P0.01;心肌梗死组:270.74±37.68 pg/ml vs 29.07±6.12 pg/ml, P0.001)浓度均显著升高。心肌梗死组与不稳定性心绞痛组相比,IL-6(P0.05)和TNF-a (P0.001)减低的程度也有显著统计学意义。 六、miR-424相对表达含量与血浆中炎症因子IL-6、TNF-α浓度的相关性分析 miR-424会抑制NFI-A蛋白的翻译和表达,而受到抑制的NFI-A蛋白会促进单核细胞向巨噬细胞分化,分化成熟的巨噬细胞分泌相应的细胞因子就会增多。因此,miR-424的表达含量应与血浆中巨噬细胞分泌的细胞因子存在有相关性。我们应用Pearson相关性分析,结果显示,miR-424的表达含量应与血浆中IL-6(r=0.461,P0.01)和TNF-α(γ=0.453, P0.01)的浓度存在显著相关性。 七、ox-LDL刺激的单核细胞中miR-424水平的变化及异黄酮的干预 ox-LDL是公认的动脉粥样硬化中刺激单核细胞转变为巨噬细胞的刺激物,为了证实在ox-LDL刺激下的单核-巨噬细胞分化过程中是否有miR-424的参与,我们进行了体外实验。实验证实,与对照组相比,单纯加入ox-LDL的单核细胞经24小时培养后,细胞内miR-424水平升高5倍(5.23±0.75 vs 1.02±0.11,P0.001)。 异黄酮作为一种PPAR-γ的激动剂,已经证实具有抑制炎症因子产生等抗炎和抗动脉粥样硬化作用。为探索异黄酮是否可以抑制ox-LDL刺激下的miR-424的升高,我们同样进行了体外培养的细胞实验。实验结果显示,异黄酮+OX-LDL组miR-424水平与单纯ox-LDL组相比显著减低(1.48±0.17 vs 5.23+0.75,P0.001),但与对照组相比无显著统计学差异(1.48±0.17 vs 1.02±0.11,P0.05),单纯异黄酮组与对照组相比亦无显著差异(1.21±0.11 vs 1.02±0.11,P0.05) 同时,细胞因子检测分析得到了类似的结果。单纯ox-LDL组IL-6、TNF-α水平显著升高,而异黄酮干预后,IL-6、TNF-α水平与单纯ox-LDL组相比显著减低,表明异黄酮可以显著抑制miR-424介导的单核-巨噬细胞的分化过程,抑制动脉粥样硬化的发生发展。 结论 冠心病患者单核细胞中miR-424表达增加,抑制了靶蛋白NFI-A的表达,NFI-A蛋白的减少进而促进了单核-巨噬细胞的分化,推动了动脉粥样硬化的发生发展。体外培养的单核-巨噬细胞分化过程中,miR-424的表达可以被异黄酮显著抑制。


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