间充质干细胞输注治疗重症肌无力的实验研究

【摘要】：背景：重症肌无力(Myasthenia Gravis, MG)是一种自身免疫性疾病,病因和确切的发病机理目前仍不清楚。研究普遍认为它是依赖于T细胞,由B细胞介导的发生在肌肉接头处,以自身反应性抗体为特征的免疫性疾病。疾病的发生过程既包括体液免疫也包括AchR特意性的T细胞免疫。各种免疫细胞的激活状态,补体系统的过度活化,以及免疫调节的失衡和干细胞微环境的改变都存在于自身免疫性疾病中。其中基质祖细胞,内皮祖细胞和骨髓微环境的功能失调也是自身免疫性疾病的发生原因之一。间充质干细胞(Mesenchymal Stem cells, MSC)是一类具有自我更新(self renewal)和多向分化潜能(multi-lineage differentiation)的成体干细胞。它是骨髓基质的组成成份之一,可以向下分化为脂肪、软骨等间质组织。MSC还有丰富的分泌功能,既能产生细胞间黏附分子如ICAM-1,LFA-1,又能分泌各种细胞因子PGE2, IDO等。研究发现,MSC通过细胞释放免疫相关的细胞因子和细胞之间直接接触能够抑制T细胞的增殖。此外,MSC还能够调节其他免疫细胞如自然杀伤细胞、树突状细胞和B细胞的免疫功能。鉴于免疫系统的过渡活化是MG的重要发病原因,而MSC具有免疫调节的能力,应用MSC细胞移植可能是一条治疗重症肌无力崭新的、有前途的策略。 目的：研究脐带/骨髓来源的间充质干细胞(MSC)对乙酰胆碱受体(AchR)诱导的实验性重症肌无力模型的治疗作用及可能的机制。为MSC应用于自身性免疫病的临床治疗提供理论依据和实验基础。 方法：建立AchR诱导的实验性重症肌无力(EAMG)的动物模型,观察不同治疗剂量nMSC对EAMG动物模型的疗效,包括临床肌无力评分的情况,体重变化,AchR-T细胞在体内体外的增殖水平。我们应用流式细胞检测技术检测了外周血和脾来源的单个核细胞中Treg (CD4+CD25+)的比率和CD4+T Foxp3的表达。实时定量PCR用来检测淋巴细胞(CD4+/CD4-)上细胞因子和共刺激分子在1nRNA水平的表达。我们应用ELISA和ELISPOT方法在体内和体外分别检测了血清中自身反应性抗体的水平和体外B细胞原位分泌抗体的水平。此外,我们还应用小动物活体成像和免疫荧光标记的方法MSC在EAMG体内的迁移情况。在体外实验中,我们还应用Trans well方法研究了当MSC与免疫细胞直接接触或不直接接触时,对CD4细胞分泌细胞因子和其表面的黏附分子表达情况的影响作用。 结果首先我们采用两种治疗方案,方案一在第一次和第二次主动免疫后第四天给与1×106MSC尾静脉注射,方案二我们采用的治疗剂量是1×107,治疗时间选择的是第二次免疫后的第1,3,5天的大剂量连续的hMSC静脉注射时,我们发现方案二治疗组临床评分比对照组没有出现明显降低。我们检测血清中抗体的水平时发现,治疗组和对照组也没有明显差异。我们发现方案一的MSC能够特意性的迁移到炎症和免疫器官并明显降低EAMG的的临床评分。并且在第二次治疗后的第10天,检测血清中抗体发现hMSC治疗组血清抗体水平低于实验组。体外对B细胞原位分泌抗体情况的检测也证实,hMSC能明显抑制B细胞分泌产生AchR抗体。体内和体外检测hMSC对AchR特意性的T细胞的增殖情况,发现hMSC在体内和体外都能抑制T细胞的增殖。MSC还能上调Treg细胞的比率,增加CD4+T内Foxp3的表达。检测细胞因子mRNA水平发现,MSC组中IL-10比EAMG组有升高的趋势,而MSC组趋化因子IP-10的水平则相对EAMG组降低。我们还检测了来自外周血和脾的淋巴细胞上黏附分子的情况,发现MSC组中外周血细胞CD4+LFA-1+T的比率较EAMG组减低。而体外分离CD4+T与MSC共培养时CD4+T LFA-1+比率也减少。我们也检测到CD4+T ICAM-1+T在MSC组中的减少。 结论：我们的研究表明,在疾病的早期给与实验性自身免疫性动物静脉输注hMSC具有治疗作用,其机制可能有hMSC的免疫调节能力相关。