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甲基转移酶抑制剂AdOx对细胞多能性相关基因调控的研究

晏丽  
【摘要】:胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESC)具有发育为三个胚层并进一步分化为各种不同类型细胞的潜能被称为多能性。自我更新和多能性维持是胚胎干细胞的两个基本特征。ESC的染色质处于一种高度开放的状态,组蛋白的甲基化修饰在早期胚胎的发生过程中起着重要的作用。 腺苷二醛(Adenosine dialdehyde, AdOx),抑制了甲基转移反应中副产物水解酶的活性,从而导致副产物在细胞中的累积而间接抑制了甲基转移过程,是一种常用的甲基转移酶的抑制剂。 小鼠P19胚胎瘤细胞(P19 embryonal carcinoma cells)具有胚胎干细胞的许多特征,具有分化成多种细胞类型的潜能和较强的自我更新能力。P19细胞在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, atRA,简称RA)诱导下,可向神经细胞方向分化。是研究胚胎干细胞多能性维持及神经分化机制的很好模型。 本论文利用AdOx处理P19细胞,初步探讨了蛋白质甲基化在P19细胞多能性维持中的作用以及在染色质水平的调控机制。 1. AdOx抑制P19细胞的神经分化潜能 P19细胞在RA诱导4天时,细胞聚集成团,在撤除RA 4天后,出现神经元样的细胞。但是用20μM AdOx预处理1天的P19细胞,不能聚集成团,几乎没有神经元样的细胞出现。通过免疫荧光染色计数法发现,未经AdOx处理的P19细胞中有75%的细胞表达TuJ1蛋白,但经AdOx预处理过的P19细胞中,仅有8%的细胞表达。Western Blot技术检测发现,在RA诱导神经分化的第8天,AdOx处理过的P19细胞中TuJ1蛋白的表达量也明显低于未经AdOx处理的P19细胞,并且,随着AdOx浓度的增加,AdOx对TuJ1蛋白表达的抑制越强。 Ngn1, Mash1和NeuroD是神经分化过程中关键的转录因子,利用Real time RT-PCR检测发现,AdOx明显抑制了RA诱导神经分化过程中ngn1, mash1和neurod mRNA的表达水平。Id1是一种与神经分化过程相拮抗的转录因子,AdOx在一定程度上促进了id1 mRNA的表达。 2. AdOx影响了P19细胞自我更新和多能性的维持 P19细胞具有较强的自我更新和多能性维持能力。我们利用流式细胞术检测了AdOx对P19细胞周期的影响。结果发现,AdOx严重引起了P19细胞周期阻滞,即使在1μM AdOx处理时就能引起明显的细胞周期阻滞,1μM,5μM和10μM AdOx主要引起S期阻滞,20μM AdOx主要引起G2/M期阻滞。AdOx引起的P19细胞周期的阻滞,严重影响了P19细胞的自我更新能力。另外,较高浓度的AdOx也能引起HEK-293A和Hela细胞的细胞周期阻滞。 Real time RT-PCR结果显示,AdOx促进了P19细胞中多能性相关基因nanog,sox2和fgf4 mRNA的表达,但抑制了多能性关键转录因子oct3/4的mRNA表达。在撤除AdOx恢复培养的P19细胞中,表达增加的多能性相关基因的mRNA水平逐渐F降,说明AdOx促进多能性相关基因表达的增加是一过性的。Western Blot结果显示,20μM AdOx增加了P19细胞中Nanog蛋白的表达量,但降低了Oct3/4蛋白的表达量。在恢复培养的P19细胞中,Nanog蛋白的表达量并未持续升高。AdOx对P19细胞中多能性基因表达产生了不同影响。 经20μM AdOx预处理过的P19细胞在加RA诱导中,干性基因的mRNA表达水平仍能够迅速下降。但是,在RA诱导的第1天,经20μM AdOx预处理过的P19细胞中lin28和fgf4的mRNA表达水平高于未处理细胞中的水平,可能会对RA诱导P19细胞的神经分化有一定干扰。 3. AdOx引起了P19细胞分化潜能的改变 我们发现AdOx严重影响了P19细胞多能性的维持,但却限制了向神经方向分化的潜能,为了研究AdOx是否引起了P19细胞向其他胚层的分化,我们采用Real time RT-PCR技术检测了AdOx处理后的P19细胞中多胚层转录因子的mRNA表达水平。结果显示,AdOx活化了P19细胞中多胚层标志基因的表达,包括内胚层的Gata6和Sox17,中胚层的Hand1和Brachyury,外胚层的Pax6以及滋养层的Bmp4和Cdx2。说明AdOx引起了P19细胞分化潜能的改变,并且与多能性基因一过性增加相类似,在撤除AdOx后恢复培养1天和2天的细胞中,mRNA表达增加的多胚层标志基因并没有继续增加,而是逐渐下降。提示AdOx处理的P19细胞可能最终也并未分化为某一特定胚层的细胞。 我们在20μM AdOx预处理过的P19细胞中,加入RA诱导2天,利用Real time RT-PCR技术检测多胚层标志基因的mRNA表达水平,结果发现内胚层的Gata6和Sox17,中胚层的Brachyury,外胚层的Nestin以及滋养层的Bmp4和Cdx2的mRNA水平均高于未经AdOx处理过的P19细胞。提示这些转录因子可能干扰了P19细胞向神经方向的特异分化。 4. AdOx在P19细胞多能性维持中染色质水平的调控作用 组蛋白甲基化修饰在染色质结构维持和基因表达调控中起着重要的作用。AdOx作为一种甲基转移酶抑制剂广泛抑制了多种蛋白质的甲基化过程。我们采用Western Blot方法检测了AdOx对P19中多种组蛋白甲基化修饰的影响,结果显示,在总染色质水平上,多种组蛋白的甲基化修饰明显下降,包括H3K27me3,H3K9me3,H3K4me2,H4K20me1,H4K20me3,H3R17me2,H3R2me2,H4R3me2,提示AdOx改变了P19细胞中的组蛋白修饰模式。 基因表达的活化必然伴随着其调控区上抑制性修饰的下降。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果表明,AdOx处理的P19细胞中,抑制性的甲基化修饰包括H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2在被AdOx活化的多能性相关基因和发育基因上均有不同程度的下降,在被AdOx抑制的oct3/4基因上下降不明显。提示AdOx可能是通过介导了抑制性甲基化修饰的降低引起了多能性相关基因和多胚层标志基因的活化。同时,H4K20me1,H4K20me2和H4K20me3在这些基因上的募集水平均高于IgG,提示H4K20的甲基化修饰也可能参与了这些基因的表达调控。 启动子活性实验结果表明,AdOx促进了nanog的启动子活性,抑制了oct3/4的启动子活性,与AdOx对nanog和oct3/4mRNA的影响一致。提示AdOx是在转录水平上影响了这两个基因的差异表达。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验结果进一步显示,抑制性的甲基化修饰H3K27me3,H3K9me3和H3K9me2在nanog基因多位点上均下降,而在oct3/4基因多位点上并无明显下降,提示AdOx可能是通过介导抑制性的甲基化修饰差异调控了P19细胞中nanog和oct3/4基因的表达。 5. AdOx对P19细胞粘附分子的影响 E-Cadherin和N-Cadherin是细胞中最常见的两种粘附分子。Real time RT-PCR结果表明,AdOx促进了e-cadherin粘附分子的表达,而对神经分化特异的n-cadherin粘附分子几乎没有显著影响。 6. AdOx对P19细胞神经分化潜能为不可逆抑制 将用较低浓度AdOx(5μM)处理P19细胞1天,撤除AdOx继续恢复培养2天后,再加RA诱导神经分化。Real time RT-PCR结果表明,神经分化过程中关键的转录因子Ngn1, Mash1和NeuroD的mRNA水平仍被明显抑制。提示AdOx对P19细胞神经分化潜能的抑制不可逆。并且,在用20μM AdOx处理1天后恢复培养10天的P19细胞中,内胚层的Gata6,中胚层的Brachyury,外胚层的Pax6和Nestin以及滋养层的Cdx2的mRNA水平均明显低于正常培养的P19细胞中的mRNA水平。提示,AdOx处理过的P19细胞可能已不再是正常的具有分化潜能的P19细胞。 7.蛋白质甲基转移酶CARM1可能在RA诱导P19细胞神经分化过程中起作用 Western Blot检测显示CARM1在RA诱导P19细胞神经分化早期明显增加,且免疫荧光实验发现CARM1入核明显,提示CARM1可能在RA诱导P19细胞的神经分化过程中起作用。 综合以上结果,我们发现AdOx限制了P19细胞的神经分化潜能,引起了P19细胞周期的阻滞,影响了P19细胞的自我更新和多能性维持能力。AdOx可能通过抑制性组蛋白甲基化修饰促进了P19细胞中多能性基因和分化相关基因的表达。抑制性组蛋白甲基化修饰差异调控了P19细胞中nanog和oct3/4基因的表达。深入研究特定蛋白质的甲基化修饰在多能性维持中的具体作用机制,有助于找到参与这些重要功能的关键性甲基转移酶。


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