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microRNA在砷致胚胎发育毒性中的作用机制研究

崔熠  
【摘要】:人群流行病学统计表明,长期暴露在含砷高的环境中,能导致生殖和胚胎发育异常,引起神经系统、心血管系统等出生缺陷。本研究以鸡胚为动物模型进一步探讨重金属元素砷对胚胎发育影响的分子作用机制。我们首先应用基因芯片筛选胚胎早期发育无机砷暴露组与正常对照组胚胎的差异mRNA和miRNA的表达谱,通过生物信息学分析差异microRNA与差异基因,构建microRNA与差异基因功能间的相互作用网络,网络图结果提示Nrp1、stmn1、HDAC4、Nrcam等基因在microRNA介导的砷干扰胚胎发育中都发挥了重要作用,且其表达水平与相应的microRNA表达呈负相关。我们的研究结果提示Nrp1基因位于mRNA和miRNA网络图的中心位置,可能是mir-181b和mir-9的一个作用靶点。神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1, NRP-1)属跨膜糖蛋白,作为轴突导向分子的受体,参与神经导向的调节,同时作为血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的共受体表达于血管内皮细胞,参与血管新生的调节。 鉴于Nrp1基因在血管生成方面发挥着重要的作用,我们以人脐静脉内皮细胞株EA.hy926为细胞摸型,研究mir-181b、mir-9调控Nrp1表达在无机砷诱导的血管增生中的作用,研究结果提示EA.hy926细胞系暴露于无机砷环境下mir-181b、mir-9表达降低,Nrp1的表达增加,且呈剂量时间依赖关系。为了探讨mir-181b、mir-9与Nrp1的调控关系,我们在EA.hy926细胞内过表达和敲低mir-181b和mir-9,研究表明过表达mir-181b和mir-9可以明显降低Nrp1蛋白水平,敲低mir-181b和mir-9表达可以增加Nrpl蛋白的表达,结果提示mir-181b和mir-9可能作用于Nrp1的3’-UTR序列,调节其表达。为了进一步证明Nrp1的3’-UTR序列包含mir-181b和mir-9作用的位点,我们将Nrp1的3’-UTR序列克隆至萤光报告载体中,并与mir-181b和mir-9的模拟物与抑制物共转染至EA.hy926细胞中,然后检测萤光素酶的活性,结果表明mir-181b和mir-9的过表达可以明显抑制萤光素酶的活性;与之相反,当我们将包含Nrp1的3’-UTR序列的萤光素酶报告载体中mir-181b和mir-9可能的结合位点剪切或突变以后,再和mir-181b和mir-9的模拟物与抑制物共转染至EA.hy926细胞中,萤光素酶的活性仅发生微弱的变化,这说明mir-181b和mir-9可以直接作用于Nrp1的3’-UTR区调控其表达。 细胞迁移实验和血管生成实验能够有效评估测定离体血管生成,我们通过细胞迁移实验和血管生成实验证明无机砷通过miRNA介导的Nrp1表达上升促进血管生成。结果提示细胞暴露在砷环境中内皮细胞的迁移数和小管生成数增加,与对照组比较,有显著性差异。而转染mir-181b和mir-9模拟物后过表达mir-181b和mir-9的细胞在暴露于砷环境中内皮细胞的迁移数和小管生成数与对照组相比无显著性差异,提示过表达mir-181b和mir-9能够逆转砷暴露所致的内皮细胞的迁移数和小管生成数增加效应,证明了无机砷暴露所致mir-181b和mir-9的降低可以通过上调Nrpl的蛋白水平,参与砷诱导的血管生成的发生,从而介导了砷的毒性作用。 综上所述,本研究从miRNA的角度研究环境污染物砷暴露所致胚胎发育毒性和畸形的分子机制,首次证明环境物质无机砷通过miRNA介导的血管发生异常干扰胚胎发育。


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