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糖原累积症的致病基因突变研究先天性皮肤松弛症的致病基因突变研究

卢超霞  
【摘要】:糖原累积症(glycogen storage disease, GSD)是一类先天性酶缺陷所造成的糖原代谢障碍疾病。这类疾病的共同特征是糖原贮存异常,多数表现为糖原在肝脏、肌肉、肾脏等组织中贮积量增加。根据其临床表现及所缺陷的酶的种类,可以将GSD分为13种类型。除了O型之外,其它类型均用罗马数字表示。其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅸ型以肝脏病变为主,Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型的肝脏损害最为严重;Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ型则以肌肉组织受损为主。除GSDⅨ(肝磷酸化酶激酶缺陷)为X连锁隐性遗传外,其余类型GSD都是常染色体隐性遗传疾病。GSD的总体发病率在新生儿中为1/20,000-43,000,其中以累及肝脏的Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅸ为常见。论文一主要对临床疑诊GSDⅠ型和GSDⅢ型的患者进行基因诊断,探索中国人中GSDⅠ型和GSDⅢ型致病基因突变规律,为临床诊断、治疗和产前诊断服务。 第一部分糖原累积症Ⅲ型的致病基因突变分析 糖原累积症Ⅲ型(Glycogen Storage Disease TypeⅢ, GSDⅢ, MIM:232400)是由糖原脱支酶(glycogen debranching enzyme, GDE; amylo-1,6-glucosidase, 4-a-Glucanotransferase, AGL)缺陷引起的常染色体隐性遗传的代谢性疾病。临床主要表现为肝肿大、饥饿性低血糖、高脂血症、生长迟缓以及进展性肌病和心肌病。AGL有两个独立的催化活性,分别是a-1,6-糖苷酶(EC 3.2.1.33)和α-1,4-糖基转移酶(EC 2.4.1.25)。完整的脱支酶活性需要糖基转移酶和糖苷酶共同发挥作用,将葡萄糖从糖原中释放出来。根据酶缺陷和累及的组织器官不同,可将GSDⅢ型分为四个亚型(a、b、c、d)。最常见的是肝脏和肌肉中AGL活性均缺乏的GSDⅢa型,约占85%。所有亚型的GSDⅢ均由AGL基因(MIM:610860)突变引起。 AGL基因位于人类染色体1p21区域,由35个外显子组成,全长85kb,编码大约7kb的nRNA。通过5’端的选择性剪接产生6种不同的转录本,特异性地表达于不同的组织。最广泛表达的转录本编码的蛋白包含1532个氨基酸,分子量大约为170kD。目前在日本、非洲及欧美等国家和地区已经有GSDⅢ型的突变研究,在AGL基因中共发现了79种突变,包括10种错义突变、22种无义突变、10种剪接位点突变、23种小的缺失突变、11种小的插入突变以及复杂缺失/插入突变、大片段缺失及复杂重排突变各一种,但在国内却仅有6例GSDⅢ型突变研究的报道。 本研究以2005年至今在北京协和医院儿科就诊的临床疑诊GSDⅢ型的87例患者为研究对象。在知情同意的基础上,我们收集患者临床资料,采集患者及其家属的外周血,提取外周血基因组DNA和RNA,通过PCR的方法对AGL基因所有编码区进行扩增,然后用直接测序的方法进行致病基因突变分析。根据发现的致病突变结果,结合临床资料,我们还探讨了基因型与表型的相关性。 结果我们在52例患者(来自50个家系,其中1个家系中的2名患者为双胞胎,1个家系中的2名患者为兄妹)中发现了58种AGL基因的突变,包括8种错义突变(13.8%)、13种无义突变(22.4%)、17种剪接位点突变(29.3%)、14种小的缺失(24.1%)、5种小的插入(8.6%)、1种复杂插入/缺失(1.7%)。其中51种突变是在国际上首次报道的。对于国际首报的7种错义突变,我们采用PCR产物限制性酶切的方法,在各家系成员及50名中国汉族正常人群中进行了筛查验证,结果未在这些正常人群中发现相同的改变。发现本研究病例中以下3种突变最为常见:c.1735+1GT(14.0%,14/100); c.100CT (p.Arg34X) (4.0%,4/100)和c.4234delC (p.G1y1413AlafsX2) (4%,4/100),这三种突变在本研究发现的突变中共占22.0%(22/100);其中c.1735+1GT在已报道过的亚洲其他人群(韩国人和日本人)GSDⅢ型患者中的突变频率为11.8%。此外,我们通过对胚胎绒毛基因组DNA进行单体型分析及基因测序,为1例高风险胎儿进行了产前DNA检测。结果证明,胎儿继承一个母源AGL致病等位基因和一个父源正常的等位基因,预期不会出现GSDⅢ型的表现。本研究还发现一定程度的基因型—表型相关性:AGL错义突变和单个氨基酸缺失突变多表现为正常的肌酸激酶水平,而其它类型的突变则表现为肌酸激酶水平显著增高。 总之,我们通过在对临床疑诊GSDⅢ型的患者进行突变检测,发现多种新的AGL基因致病突变,构建了中国人的AGL基因突变谱,丰富了人类AGL基因的致病突变数据库;发现GSDⅢ型中存在基因型-表型相关性;同时,完成一例高患病风险胎儿的产前DNA检测。这些工作为深入认识GSDⅢ型的分子机制和在中国人群中更好开展GSDⅢ型的基因诊断工作奠定了基础。 第二部分糖原累积症Ⅰ型的致病基因突变研究 糖原累积症Ⅰ型(Glycogen storage disease type I, GSD I)是一组由葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)体系缺陷引起的常染色体隐性遗传病,总体发病率约为1:100,000。G6Pase体系主要由4个组分组成:葡萄糖-6-磷酸酶-α(glucose-6-phosphatase-a,G6PC)、葡萄糖-6-磷酸转运体(glucose-6-phosphate transporter, G6PT1)、无机磷酸盐转运体(T2)、葡萄糖转运体(T3),分别行使葡萄糖-6-磷酸(G6P)的水解,G6P的转位,磷酸的运输和葡萄糖运输的功能。根据缺陷的酶的不同将GSDⅠ分为4个亚型:GSDIa(MIM:232200)由G6PC缺陷引起;GSDIb(MIM:232220)由G6PT1缺陷引起;GSDIc (MIM:232240)和GSD Id则分别由T2和T3缺陷引起。 GSDⅠa是GSDⅠ型中最常见的亚型,大约占GSDⅠ型的80%,典型的临床表现为严重的低血糖、肝脏肿大、生长落后和出血倾向,并可伴有高脂血症、高尿酸血症、高乳酸血症。其长期的并发症可有痛风、有转移倾向的肝腺瘤、血小板功能障碍、肾功能不全、骨质疏松等。GSDⅠa由G6PC基因(MIM:232200)突变引起。GSDⅠb在GSDⅠ型中第二常见,约占15%。GSDⅠb由G6PT1基因(MIM:602671)突变引起。除了与GSDⅠa具有相似的临床表现外,GSDⅠb患者还经常表现为中性粒细胞减少症及炎症性肠病。但不典型的GSDⅠb患者也可无中性粒细胞减少症的表现,一些GSDⅠa型患者也可以表现出轻度的中性粒细胞减少症。因此明确的鉴别诊断依赖于G6PC基因和G6PT1基因的突变分析. GSDIc和GSD Id发病率很低,其分子机制还没有完全阐明,但在部分GSDIc和GSD Id患者中也检测到了G6PT1基因的突变,因此现在倾向于将GSDⅠ型分为GSD la和GSD I non-a两种亚型。 G6PC基因位于人类染色体17q21区域,全长12.5kb,含有5个外显子,编码含357个氨基酸的蛋白。GSDⅠa的发病率无种族差异。目前为止,在不同种族和地区的GSDⅠa型患者中报道了大约89种G6PC基因突变,突变类型多样。在所有GSD la患者中最常检测到的突变有p.Arg83Cys (29.0%), c.648GT (16.4%), p.Gln347X (14.3%)和p.Arg83His (3.9%).目前有研究显示,在中国人GSD Ia患者G6PC基因中c.648GT占54%, p.Arg83His占26%,日本人和韩国人GSD la患者中G6PC基因的突变频率分别为91%和75%。 G6PT1基因定位于人类染色体11q23区域,包含9个外显子,全长约5.3kb,编码由429个氨基酸组成的蛋白。目前为止,在不同国家与地区已经对150多例GSD I non-a型患者进行了分子遗传分析,这些患者大部分是GSDIb型,还有6例GSDⅠc型患者和1例GSD Id型患者。他们均由G6PT1基因发生突变引起。在这些患者中报道了大约82种G6PT1基因突变,包括了几乎所有的突变类型,其中最主要的突变类型是错义突变(35/82,42.7%)。G6PT1基因的常见突变在不同的人种中有所不同。在高加索人中,p.Leu348ValfsX53是最常见的突变,突变频率约为32%;在日本人中,最常见的突变是p.Trp118Arg,其突变频率约为44%。而在中国人群中对该病的研究甚少。 本研究以在北京协和医院儿科就诊的64例疑诊GSDⅠa型的患者和12例(来自10个家系)疑诊GSDⅠb型的患者为研究对象。在知情同意的基础上,采集患者及其家属的外周血,提取外周血基因组DNA和RNA,对G6PC基因和G6PTl基因所有编码区进行PCR扩增,然后直接测序进行致病基因突变分析。并采用高分辨率熔解曲线(high resolution melting, HRM)对10例GSDⅠa型患者(已经PCR测序分析)进行中国人群中G6PC基因常见突变c.648GT的检测,探讨HRM在诊断GSDⅠa型患者常见突变的应用。 我们在27例GSDⅠa型患者中检测到了致病的G6PC基因突变,共发现14种致病突变:7种错义突变,4种无义突变,2种小的缺失突变和1种剪接位点突变。其中5种突变是国际上首次报道的。研究结果还显示热点突变c.648 GT和p.Arg83His的频率在本研究患者中分别占44.4%和16.7%,稍低于其他研究者报道的在中国GSDⅠa患者中的频率(分别为54%和26%)。应用HRM的方法对10例GSDⅠa型患者进行了c.648GT点突变的检测,有效地鉴定出4例杂合突变、4例纯合突变、1例野生型以及1例其它突变,与PCR测序结果完全吻合,验证了HRM对GSDⅠa患者该热点突变检测的准确性和可行性。 我们在全部12例GSDⅠb型患者中检测到了G6PTl基因致病突变,共发现了10种突变,包括6种错义突变,2种剪接位点突变,1种无义突变和1种小的缺失突变,其中6种突变为国际首次报道。在本研究患者中最为常见的突变是p.Pro191Leu (7/20,35%),与已报道的其他种族人群中的常见突变都不同,该突变是否为中国人群GSDⅠb患者中的常见突变,还需要加大样本量进一步研究。 总之,本研究应用以外周血基因组DNA为基础的方法,对临床上疑诊GSDⅠa型和GSDⅠb型患者进行了基因检测;还证实了应用HRM方法检测GSDⅠa型患者常见点突变的可行性。研究结果丰富了人类GSDⅠ型突变数据库,基本证实了以往报道的中国GSDⅠa患者中的热点突变,并首次发现了中国GSDⅠb患者中的可能常见突变为以后对GSDⅠ型进行更深入的分子水平研究奠定了基础。 皮肤松弛症(Cutis laxa, CL)是一组以皮肤松弛、下垂、无弹性以及伴或不伴内脏器官受累为临床表现的遗传性或获得性结缔组织疾病。遗传性CL具有高度遗传异质性,根据其遗传方式的不同可分为常染色体显性(Autosomal dominant,MIM:123700)、常染色体隐性(Autosomal recessive typeⅠ, MIM:219100; Autosomal recessive typeⅡ, MIM:219200)和X连锁隐性遗传(X-linked recessive,MIM:304150)。常染色体显性CL表现较轻,很少累及内脏器官,患者可以有较长的生命期;常染色体隐性CL虽然较为少见,但症状表现较重,常常危及生命。而获得性CL多发生于创伤和发热性皮疹后,全身或局部出现皮肤松弛。 遗传性CL的致病基因有多个,包括ELN、FBLN4、FBLN5、ATP6V02和ATP7A,发生于FBLN5和ELN基因中的突变既能引起常染色体显性CL又能引起常染色体隐性CL,其中较为常见的是弹力蛋白基因(ELN,MIM:130160)。ELN基因位于人类染色体7q11.2区域,全长45kb,由34个外显子组成,编码由724个氨基酸组成的弹力蛋白。弹力蛋白一级结构表现为交替出现疏水性结构和赖氨酸丰富的可形成共价交联的结构,疏水性结构赋予蛋白弹性特征,赖氨酸丰富的结构使弹力蛋白原单体相互共价交联生成不溶性的弹力蛋白多聚体。作为弹性纤维的主要成分,弹力蛋白广泛存在于结缔组织(如动脉血管、肺、皮肤和韧带)中,赋予组织弹性回复力和对外力耐受性。迄今为止,共有9例关于ELN基因突变引起CL的报道,除一例为获得性CL之外,其他均为遗传性CL。总结导致CL的ELN基因突变类型共有9种,其中包括四种小缺失突变、两种错义突变、一种剪接位点突变、一种大片段缺失突变以及一种串联重复突变。值得注意的是,这些导致CL的突变多发生于ELN基因的3’末端。 本研究以一轻型先天性皮肤松弛症患儿为研究对象。该患儿主要临床表现为出生后全身皮肤松弛、下垂、成熟貌、声音嘶哑、大耳。体检结果显示未见其它器官系统异常。其父母表型正常,无近亲婚配家族史。获得知情同意后采集家系成员外周血,进行致病基因突变检测。常规提取基因组DNA,针对ELN基因的3’端外显子(外显子28-34)及外显子-内含子交界处设计引物,PCR扩增产物纯化后直接测序。测序结果显示患儿在ELN基因外显子28和内含子33内存在2个核苷酸改变:c.1819GC和c.2132-7CA,均为未曾报道过的突变。对患儿父母进行ELN基因检测,结果显示c.1819GC突变遗传自父亲,而c.2132-7CA突变为新生突变。为验证这两个核苷酸改变是否为正常人群中的单核苷酸多态,我们在120名中国汉族正正常人群中采用限制性内切酶酶切方法进行了筛查验证。酶切结果显示这些正常人群中未见这两种核苷酸改变。我们对患者和正常对照者进行了皮肤成纤维细胞原代培养,从培养细胞中提取总RNA,然后反转录成cDNA,对cDNA进行PCR扩增、测序。结果显示c.2132-7CA突变使第33内含子3’端产生了新的剪接位点,导致mRNA中相应位置插入5个核苷酸,预计会使编码氨基酸由711位甘氨酸开始,其后的所有氨基酸发生移码,最终产生了比正常肽链长27个氨基酸的异常肽链,从而改变了整个弹力蛋白的C端结构。用ClustalX 1.83进行多重序列比对显示弹力蛋白肽链中第607位的甘氨酸和外显子34编码的C末端氨基酸均在不同物种中高度保守,提示本研究发现的2个突变为致病突变。我们对原代培养的皮肤成纤维细胞用鼠抗人单克隆抗体进行免疫化学染色,结果显示弹力蛋白在患者和正常对照个体皮肤成纤维细胞中表达无明显差异,提示c.1819GC和c.2132-7CA两个突变的产生可能对弹力蛋白的合成与分泌无影响。鉴于患儿父亲含有一个与患儿相同的错义突变而表型完全正常,考虑本报道家系中的遗传模式为常染色体隐性遗传。 综上所述,本研究报道了ELN基因上的2个新的复合杂合突变(c.1819GC和c.2132-7CA)是导致常染色体隐性CL的原因,此结果丰富了ELN基因致CL的突变数据库。本研究是国际上第2例ELN基因突变引起常染色体隐性CL的报道,加深了对先天性CL遗传异质性的认识。


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