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人羊膜间充质细胞移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的影响及其机理探讨

杨凌  
【摘要】:第一部分体外培养人羊膜间充质细胞的神经生物学特征研究 目的:探讨体外培养的人羊膜间充质细胞(human amnion mesenchymal cells, hAMCs)的神经生物学特征、神经营养作用,以及hAMCs与新生鼠脑组织液共培养后向神经细胞分化的潜能。方法:1.应用免疫细胞化学法检测hAMCs的间充质细胞标记蛋白STRO-1、vimentin,神经干细胞标记蛋白nestin、PSA-NCAM,神经细胞标记蛋白β-tubulin-Ⅲ、TH,以及与神经发生相关蛋白Math-1、Mash-1的表达。应用PCNA形态学检测、BrdU掺入法和MTS法确认hAMCs的增殖活性。2ELISA检测培养7d后的hAMCs内及细胞培养上清液中的神经营养因子NT3、β-NGF和BDNF的合成分泌状态。3.将10日龄新生SD大鼠脑组织匀浆上清液与hAMCs共培养10d后,应用免疫蛋白印记法比较共培养前后vimentin、NSE、NF表达的变化。结果:1.体外培养的hAMCs不仅表达间充质干细胞标记蛋白STRO-1和vimentin,还可见神经干细胞标记蛋白nestin和PSA-NCAM的表达;2.体外培养的hAMCs表达神经元标记蛋白β-tubulin-Ⅲ、TH,同时还表达神经发生相关蛋白Math-1、Mash-1; 3. hAMCs表现为PCNA和BrdU免疫荧光染色阳性;4.MTS分析法显示hAMCs在接种后第6~8d增殖速度最快,第8~24d活细胞数基本保持稳定。5.部分hAMCs表现为TH/BrdU和β-tubulin-Ⅲ/BrdU双阳性。6hAMCs内及细胞上清中均检测到不同水平的NT3、β-NGF和BDNF神经营养因子的合成分泌。7.与新生大鼠脑组织上清液共培养后,hAMCs的vimentin、神经元特异性标记蛋白NSE、NF的表达数量显著增加。结论:体外培养的hAMCs表达神经干细胞和神经元的特异性标记蛋白,并且具有增殖活性和神经细胞分化潜能。体外培养hAMCs能够分化为神经细胞,这可能与神经元分化相关基因Math-1、Mash-1的表达有关。此外,hAMCs可以合成和分泌多种具有神经保护和修复作用的神经营养因子。新生鼠脑中存在的神经营养因子,能够促使hAMCs向神经元方向分化,提示脑内具有有利于hAMCs向神经细胞分化的微环境。 第二部分体外培养人羊膜间充质细胞向血管内皮细胞诱导分化的研究 目的:探讨hAMCs在体外诱导分化为血管内皮样细胞的潜能,以期作为细胞移植治疗缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury, H1B1)的种子细胞。方法:1.从健康产妇足月剖宫产后废弃的人羊膜组织分离培养hAMCs,利用细胞培养技术完善体外扩增培养方法,并对其相关生物学特性进行鉴定。2.使用添加血管内皮细胞生长因子(VEGF).碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的血管内皮细胞诱导培养基培养hAMCs,观察细胞形态特征,用免疫荧光染色和Western-Blot的方法检测血管内皮细胞特异性标记蛋白CD31、vWF和VEGFR-2的表达。结果:1.原代培养的hAMCs形态呈长梭形或不规则形,呈均匀分布生长,传代后细胞体积略变大,约5~7d传代1次。2.体外培养的hAMCs表达间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)特异性标记物STRO-1和vimentin。经成血管内皮细胞诱导培养基培养12d后,hAMCs中有CD31、vWF和VEGFR-2表达阳性的细胞。结论:hAMCs易于体外分离培养及扩增,体外定向诱导的hAMCs具有向血管内皮细胞分化的潜能,可能成为治疗HIBI的供体细胞。 第三部分人羊膜间充质细胞移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的影响 目的:观察hAMCs移植对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischaemic brain injury, HIBI)的影响。方法:从健康产妇是月剖宫产后废弃的人羊膜组织分离培养hAMCs。采用新生7日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠结扎左颈总动脉后低氧暴露4h制作HIBI模型。建模72h后,移植组(n=33)经损伤侧脑内直接注射hAMCs 2×104细胞/4μl基础培养基,移植对照组(n=23)则注入等量的基础培养基。观察HIBI后大鼠体重增长情况,行为能力以及脑组织病理形态学改变;观察hAMCs移植对新生大鼠存活率、体重增长的影响;移植后7d应用HNA和HMA免疫组织化学染色检测hAMCS在脑内的存活情况;移植后11d用ELISA法检测移植后对脑内NT3、β-NGF和BDNF水平的影响。结果:1HIBI模型组体重增长明显落后于空白对照组和假手术组;HIBI制模后大鼠出现不同程度的神经功能受损表现;HE染色可见左侧大脑半球神经元损伤及神经胶质细胞增生。2.移植组和移植对照组的死亡率无差异;d7后移植组的体重增长率较移植对照组逐渐增高。3.在移植大鼠的皮层下部分区域均发现了人源性细胞特异性标记蛋白HNA和HMA阳性细胞的表达。4.移植后大鼠脑组织中NT3和BDNF较移植对照组增加,有统计学差异;而β-NGF含量无明显变化。结论:本研究中新生大鼠HIBI模型是可靠的。hAMCs脑内移植可以在新生HIBI大鼠脑内存活,并通过促进脑内神经营养因子的合成和分泌,发挥其神经保护和修复作用。


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