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miR-9、miR-125b在喉鳞癌中的生物学功能研究

牛燕燕  
【摘要】:喉癌是头颈部第二常见的原发恶性肿瘤。早期喉癌通过手术和放疗预后较好,但晚期喉癌5年生存率仅有51%左右。近年来手术、放疗技术的提高以及同步放化疗的开展,在一定程度上改善了喉癌的预后,但由于相当一部分喉癌患者发现时已为晚期,且对于局部复发和转移的患者治疗上无重大进展,因此近几十年来喉癌的生存率一直没有明显的提高。为了能早期发现喉癌并改善其治疗效果和预后,就需要我们更深入的了解喉癌发生发展的机理。 microRNA是一类进化上保守的内源性非蛋白质编码小分子RNA,长度约为20-24个核苷酸,通过与mRNA互补结合,在转录后水平抑制靶基因的表达。大量研究表明,miRNA在肿瘤组织和正常组织之间的表达存在差异,并且发挥着类似癌基因或者抑癌基因的作用。最近已有研究报道了在头颈肿瘤中差异表达的miRNAs,但相关miRNA在头颈肿瘤中的具体功能及分子机制的研究仍留有很大空白。本研究旨在初步探讨miRNA在喉癌发生发展中的生物学功能及其内在分子机制,为寻找喉癌早期肿瘤分子标志物及后续的喉癌基因治疗奠定基础,以最终提高喉癌的早期诊断率并改善治疗效果。结合文献,本实验选取在头颈肿瘤组织中高表达的miR-9和低表达的miR-125b进行研究,并将唯一一个已证实在喉癌中高表达且有明确生物学功能的miR-21作为整个实验的阳性对照。 我们首先用real-time PCR的方法检测了miR-9、miR-125b和miR-21在10对配对喉鳞癌和癌旁正常组织、人喉癌细胞株Hep-2和10例正常组织中的表达差异。结果发现,在喉鳞癌组织和人喉癌细胞株Hep-2中miR-9和miR-21表达上调,miR-125b表达下调,与文献报道的用miRNA芯片技术检测的结果相符。随后,我们在人喉癌细胞株Hep-2中转染miR-9 ASO、miR-21 ASO、miR-125b成熟序列以及相应对照,并用MTT实验分析转染后对细胞增殖的影响。发现在Hep-2细胞中敲低miR-9和miR-21后72小时和96小时测得的活细胞数目明显减少,而过表达miR-125b后活细胞数目虽有所减少,但无统计学意义。 为了明确在Hep-2细胞中敲低miR-9和miR-21后活细胞数目明显减少是通过哪条途径实现的,我们进一步用流式细胞术分析了敲低miR-9、miR-21和过表达miR-125b后Hep-2细胞周期的变化。结果提示,在Hep-2中敲低miR-9和miR-21后,G1期所占的百分比增加,S期和G2期相应减少。而过表达miR-125b对细胞周期影响不明显。抑制细胞增殖的作用除了通过抑制细胞从G0/G1期发展到S期,还可能通过促进凋亡来实现。为此我们用TUNEL实验分析了在Hep-2细胞中敲低miR-9和过表达miR-125b后对细胞凋亡的影响。结果显示,实验组和对照组中凋亡细胞数目无明显差异。此外,为了检测miR-9对Hep-2细胞存活能力的影响,我们还进行了细胞存活能力的实验(Survival实验)。结果显示在无血清培养基中,和对照组相比,转染miR-9 ASO后Hep-2活细胞数量减少,说明敲低miR-9后Hep-2细胞的存活能力降低。 由于miRNAs往往通过调控下游靶基因发挥作用,为了进一步阐述miR-9在喉鳞癌中发挥功能的分子机制,我们利用生物信息学的方法首先分析了miR-9在人类基因组中的位置及其序列的保守性,随后通过miRanda、TargetScan和PicTar软件对miR-9可能的靶基因进行了预测。 综合以上结果,我们初步证明:miR-9在喉鳞癌组织及人喉癌细胞株Hep-2中表达明显上调。敲低miR-9可以通过调控细胞周期,使Hep-2细胞阻滞在Gl期而抑制Hep-2细胞增殖,同时,敲低miR-9使Hep-2细胞的存活能力下降,但无明显诱导凋亡的作用。因此,我们考虑miR-9在喉癌中可能发挥了类似“癌基因”的作用。miR-125b在喉鳞癌组织及人喉癌细胞株Hep-2中表达明显下调,但在人喉癌Hep-2细胞中过表达miR-125b无明显的生物学效应。作为整个实验阳性对照的miR-21的结果与之前文献的报道均相符,间接证明了本实验的可靠性。生物信息学软件预测miR-9的靶基因共631个,缩减了候选靶基因的范围,为进一步明确miR-9的靶基因并研究其作用机制提供了依据。


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