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可降解铁支架可行性的初步研究

吴超  
【摘要】:第一部分铁对人主动脉平滑肌细胞增殖影响的体外实验研究 药物洗脱支架(DES)是介入心脏病学的重要进展,使支架内再狭窄率下降到10%以下。但DES中不能降解的多聚物涂层可能会引起炎症反应,DES携载的抗细胞增殖药物虽有效地抑制了支架置入术后血管平滑肌细胞过度增生,但同时也抑制了血管内皮细胞再生,延迟内皮愈合,从而增加支架内血栓的风险。 生物可降解支架可在完成其防止血管弹性回缩和药物释放的作用后自行降解吸收,避免对血管舒缩功能的不利影响。目前用于可吸收的金属支架的材料主要是镁合金和铁。镁合金力学性能差于不锈钢和钴铬合金,且分解吸收较快,使得支架在术后过早失去支撑功能。铁的支撑力强于镁,能有效预防早期血管弹性回缩。有研究证明,在猪的冠状动脉内置入可降解铁支架,显示局部血管壁无炎症反应,血管内膜无明显增生。亦有体外细胞培养实验研究表明,铁可抑制人血管平滑肌细胞的增殖。铁有潜在可能成为可降解金属支架的材料。铁支架在降解过程中,支架表面首先释放出二价铁,二价铁可被氧化成三价铁或与邻近组织发生相互作用。由于支架被血管平滑肌细胞包围,因此研究二价铁和三价铁对平滑肌细胞的影响具有重要意义。现有细胞培养研究表明,铁通过减少血管平滑肌细胞生长相关基因mRNA的表达,起到抗平滑肌细胞增殖的作用,但目前尚缺乏蛋白水平的研究。 目的 本研究通过体外实验,培养人主动脉平滑肌细胞(HASMC), WST-1法检测不同浓度的葡萄糖酸亚铁[可溶性二价铁,Fe(Ⅱ)]和氯化铁[可溶性三价铁,Fe(Ⅲ)]对HASMC增殖的影响。在蛋白水平上,通过检测Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)干预后HASMC增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白P53的表达,探讨Fe(Ⅱ)]和Fe(Ⅲ)在增殖和凋亡方面对HASMC的影响。 方法 一、WST-1法检测Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)对HASMC增殖的影响 通过体外扩增、培养HASMC细胞株。Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)浓度分别为100μmol/L,200μmol/L,300μmol/L,400μmol/L,500μmol/L干预培养HASMC,干预6小时、12小时、24小时,WST-1法检测细胞增殖活性,计算细胞增殖抑制率,探讨Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)对HASMC抑制增殖作用与时间、浓度的关系。使用SPSS10.0软件统计分析。 二、免疫印迹法(Western Blot)检测Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)对细胞增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白P53表达的影响 HASMC接种培养24小时后,分别加入Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)100μmol/L,300μmol/L,500μmol/L,正常对照组予含2%血清的SMCM培养。药物干预6小时、12小时、24小时,提取细胞总蛋白。Western Blot法检测HASMC的细胞增殖核抗原PCNA和凋亡蛋白P53的表达情况。 结果 一、Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)对HASMC增殖的影响 Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)对HASMC都表现出不同程度的抑制HASMC增殖的作用,且呈浓度依赖性。Fe(Ⅱ)300umol/L,400umol/L和500umol/L干预6小时的增殖抑制率分别为34.25%,50.11%和50.80%,干预12小时的增殖抑制率分别为46.35%,58.19%和66.05%,干预24小时的增殖抑制率分别为32.74%,38.79%和49.28%。500umol/L组的抑制率在三个时间点分别是300umol/L组的1.48倍,1.43倍和1.51倍。Fe(Ⅲ)1OOumol/L,200umol/L,300umol/L,400umol/L和500umol/L干预6小时的增殖抑制率分别为21.70%,36.74%,41.45%,45.81%和47.49%,干预12小时的增殖抑制率分别为35.38%,49.97%,59.14%,65.77%和69.17%,干预24小时的增殖抑制率分别为11.57%,28.58%,38.93%,48.70%和55.42%。500umol/L组的抑制率在三个时间点分别是100umol/L组的2.19倍,1.96倍和4.79倍。但是Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)对HASMC增殖的抑制作用并未表现出时间依赖性,在12小时时,抑制作用最强。 二、Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)干预培养后HASMC增殖蛋白PCNA和凋亡蛋白P53表达的变化 在Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)100umol/L,300umol/L和500umol/L三个浓度组,至24小时各组PCNA表达量均明显减少,对照组无明显改变。与对照组相比,24小时PCNA在Fe(Ⅱ)组和Fe(Ⅲ)组的表达量均减少,且均随着浓度的增加其减少更为明显。PCNA在Fe(Ⅲ)组表达量低于Fe(Ⅱ)组。 P53在各组中12小时比6小时表达量减少,至24小时表达量又增加,对照组却有下降趋势。与正常对照组相比,各时间点P53在Fe(Ⅱ)组和Fe(Ⅲ)组的表达量均增加,且均随着浓度的增加而逐渐增加,24小时P53表达量较对照组增加最为明显。P53在Fe(Ⅲ)组表达量高于Fe(Ⅱ)组。 结论 本研究表明,Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)均有抑制HASMC增殖的作用,且呈浓度依赖性。其机制与Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)使HASMC增殖蛋白PCNA的表达减少和促凋亡蛋白P53的表达增加有关。可溶性三价铁对HASMC增殖的抑制作用可能强于可溶性二价铁。由于支架置入后平滑肌细胞过度增生是造成再狭窄的主要机制。铁的上述特性对作为可降解支架的材料具有重要意义。 第二部分可降解铁支架在小型猪冠状动脉模型的初步研究 金属裸支架(BMS)置入术后仍有大约15—30%的患者出现再狭窄,药物洗脱支架(DES)使支架内再狭窄发生率显著降至10%以内。但与裸金属支架相比,DES轻度但有统计学意义地增加了晚期支架血栓的发生率,这可能与不可降解的涂层在局部造成持续炎症反应和过敏反应有关。为避免不可降解的聚合物涂层永久残留于血管壁中所引起的不利作用,进一步避免永久残留于血管壁中的金属支架对血管壁的长期异物刺激,发展全降解的DES使其在完成防止血管弹性回缩和释放药物的作用后从血管壁中被完全降解吸收,是新型DES发展的趋势之一。铁是安全的可降解金属,有潜在可能成为可降解金属支架材料,但目前关于铁可降解支架的动物实验有限。 目的 为产学研结合开发国产可降解铁支架,本研究在健康小型猪冠状动脉模型观察可降解渗氮铁支架(先健公司,深圳)的生物安全性和对新生内膜增生的影响,并与Vision钴铬合金支架进行对比,初步探索铁支架的可行性。方法 8只铁支架和8只Vision支架随机分别置入8头健康小型猪的冠状动脉前降支及右冠状动脉,每头猪置入相同品牌支架。术后4周时将动物处死,进行组织病理学分析,测量支架处冠状动脉平均内膜厚度、新生内膜面积、面积狭窄百分比及形态学改变,免疫组化染色观察细胞增殖蛋白PCNA表达;通过扫描电镜(SEM)观察内皮愈合情况,通过OCT观察支架杆覆盖率;并观察支架置入周围组织、心、肝、脾、肺、肾及脑组织的形态学改变及有无铁沉积。 结果 铁组与Vision组相比,4周时平均内膜厚度(0.46±0.17mm比0.45±0.18mm,P=0.878)、新生内膜面积(2.55±0.91mm2比3.04±1.15mm2,P=0.360)和面积狭窄百分比(44.50±11.40%比46.00±17.95%,P=0.845)差异均无统计学显著性;两组均有2例重度狭窄;均未见血栓、炎症及组织坏死征象两组SEM评分(0.75±1.04比0.88±0.99,P=0.809)和PCNA染色阳性(19.75±4.11%比23.25±4.86%,P=0.314)均无显著性差异,铁支架组的内皮覆盖内膜白分比(84.38±14.50%比65.00±22.04%,P=0.057)有增高的趋势,但未达到统计学显著性。OCT观察两组的最小管腔直径(1.81±0.18mm比1.76±0.36mm,P=0.785)、最小管腔面积(3.34±0.56mm2比2.96±0.82mm2,P=0.436)差别无显著性;两组支架杆覆盖率均非常高(99.63±0.38%比99.66±0.68%,P=0.927),无显著性差异。铁支架4周时已开始降解,铁支架组的支架杆周围组织可见铁染色阳性,该区域未见炎性改变。两组的脾脏的铁染色为阳性,余脏器铁染色为阴性,各脏器均未见异常组织学改变。 结论 本研究结果显示,铁支架置入健康小型猪冠状动脉4周显示良好的组织相容性和血液相容性。支架置入术后4周内膜增生情况与对照组Vision支架类似;未见血栓、炎症及组织坏死征象。SEM显示内皮细胞覆盖面积约占总内膜面积的84%。OCT检查支架杆覆盖率达99%。支架置入4周后已可见支架被腐蚀降解,但未见铁过负荷及与铁相关的局部或实质性脏器的损害。。本研究结果初步提示可降解铁支架可行,值得进一步研究。


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