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2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐对学习记忆的改善作用及其影响长时程增强的机制研究

李萍萍  
【摘要】:阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease, AD)又称老年痴呆,是中枢神经系统一种常见的退行性疾病,其典型特征为病人进行性记忆缺失,并发生行为、语言、视觉空间障碍。AD已经成为继心血管疾病、癌症和脑卒中之后,严重危害老年人健康的主要疾病。其病理学改变主要包括神经元的丢失及神经突触体的减少、含有Tau蛋白的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)和Aβ沉积形成的老年斑(senile plaque, SP)。目前用于AD治疗的药物只能改善其认知功能障碍和行为症状,但不能治愈和停止病情发展。 2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐(Potassium2-(1-Hydroxypentyl)-benzoate, dl-PHPB)是中国医学科学院药物研究所自行设计合成的全新化合物,并已被国家食品药品监督局批准为抗缺血性脑卒中新药。它是抗缺血性脑卒中药丁基苯酞(3-n-butylphathlide, dl-NBP)的前体,在体内可以通过PH值改变或生物酶系统作用转化为丁基苯酞而发挥其药效学作用。在以往的研究中发现,dl-PHPB不仅具有显著的抗脑缺血作用,还对慢性脑低灌注大鼠、Aβ诱导的痴呆大鼠及快速老化小鼠的认知缺陷有改善作用。为了进一步明确dl-PHPB改善学习记忆的作用,并探讨其作用机制,本研究观察了dl-PHPB对生理状态下及化学诱发学习记忆障碍的病理状态下,大鼠海马长时程增强(long-term potentiation, LTP)的作用,并且在APP/PS1转基因小鼠中进一步证实了dl-PHPB改善认知功能及神经突触损伤的作用。2-(α-羟基戊基)苯甲酸钾盐对麻醉大鼠海马LTP的影响 中枢神经系统的高度可塑性,被认为是学习记忆的神经生物学基础,其核心包括突触连接的结构和功能的可塑性。长时程增强(long-term potentiation, LTP),是指在条件刺激下诱发的突触传递功能的长时间增强现象,它是突触传递功能可塑性的重要表现形式,是在突触水平上研究学习记忆神经机制的理想模型。许多病理因素均可以影响动物脑内LTP水平。因此,观察药物对LTP的影响对于了解药物在神经突触可塑性方面的作用具有重要意义,可为阐明药物改善认知功能的机制提供重要实验证据。为此,我们依据经典的HFS诱发的LTP记录方法,在本实验室建立了麻醉大鼠海马LTP实验平台,观察dl-PHPB对生理状态下及各种化学因素诱发的学习记忆障碍病理状态下由大鼠穿通纤维(perforant pathway, PP)至齿状回(dentate gyrus, DG)颗粒细胞层神经通路(即PP-DG通路)LTP的影响。 我们首先观察了dl-PHPB对正常生理状态下LTP的影响。10μM dl-PHPB可以在并不影响基础突触传递水平的情况下,显著增强高频刺激(high frequency stimulation, HFS)诱发的LTP,此作用可持续至少60min。为了进一步探讨dl-PHPB所致的LTP增强现象的可能机制,在给予10μM dl-PHPB前10min,侧脑室注射NMDA受体拮据剂D-APV,结果显示D-APV150μM几乎完全阻断了dl-PHPB所致的LTP增强现象,其LTP诱发水平与单纯给予D-APV150μM基本一致。然而在给予dl-PHPB前10min注射非NMDA受体拮抗剂DNQX并不能完全阻断dl-PHPB所致的LTP增强现象。以上结果表明,dl-PHPB介导的LTP增强作用可能通过NMDA受体发挥作用。 之后,我们主要探讨了dl-PHPB在各种化学因素诱发学习记忆障碍模型中的作用。 东莨菪碱是非选择性M胆碱受体拮抗剂,由于其可模拟胆碱能功能低下导致的痴呆,在抗痴呆药物的评价中得到广泛应用。在东莨菪碱所致大鼠学习记忆损伤实验中,东莨菪碱模型组大鼠在水迷宫实验中表现出明显的学习记忆和空间定向能力障碍,口服给予dl-PHPB100mg/kg或加兰他敏2.5mg/kg可明显改善东莨菪碱所致的学习能力和记忆损伤。LTP实验结果显示,东莨菪碱可以显著抑制大鼠海马PP-DG通路LTP水平,损伤神经突触传递效率。口服给予dl-PHPB100mg/kg对东莨菪碱所致神经传递损伤有明显改善作用。 细胞外由Ap沉积而形成的老年斑是阿尔茨海默病的主要病理特征之一。p-淀粉样蛋白(Aβ)是由其前体APP蛋白剪切加工而成,其主要的存在形式有Aβ40和Aβ42,且这两种形式的Ap在AD病人脑中都有明显升高。近年来,越来越多的研究表明,寡聚体形式的Ap具有更强的神经细胞毒性,并且可以明显抑制脑内LTP水平。因此,我们建立了Aβ1-42诱导的大鼠神经损伤模型,发现寡聚体Aβ1-42可对HFS诱导的大鼠海马PP-DG通路LTP产生明显的抑制作用,而口服dl-VHPB可显著改善Aβ1-42所致LTP损伤。 慢性神经炎症反应普遍存在于AD患者脑内,是神经退行性病变的重要因素。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分,可以作为非特异免疫刺激物质,引起炎症反应。有研究表明,LPS及其引起的炎症反应可影响脑内的神经元和胶质细胞,并且可以造成海马LTP损伤。因此,我们建立了LPS诱导的损伤模型,观察腹腔注射LPS对大鼠海马LTP的影响。结果表明,在LPS注射1天,大鼠海马LTP水平有下降趋势,LPS注射3天和30天后,LTP水平有显著的降低,说明LPS对大鼠海马突触传递效率有明显的损伤作用。而口服dl-PHPB并不能明显改善LPS注射引起的大鼠海马LTP损伤。 综上所述,本部分研究提示,dl-PHPB可能通过影响NMDA受体而增强生理状态下大鼠海马LTP水平,并且口服dl-PHPB可以拮抗胆碱能系统损伤及Aβ损伤造成的LTP抑制作用。 遗传因素是AD的主要发病机制之一,现在已发现多种基因与AD相关,如β淀粉样蛋白前体(APP)基因,早老素1(PS1)基因,早老素2(PS2)基因及载脂蛋白E(apoE)基因等。随着转基因技术的不断成熟发展,各种转基因动物模型被广泛应用于AD的疾病研究和治疗药物评价。其中,APP/PS1转基因小鼠脑内Ap沉积的量多,分布广,并且神经变性及行为学改变明显,是研究AD病理机制较为理想的动物模型。在本部分研究中,我们采用13月龄APP/PS1双转基因小鼠,口服给予dl-PHPB (100mg/kg)一个月后,通过观察各组动物的被动回避学习记忆能力、高频刺激诱发的LTP水平及动物脑组织中相关蛋白表达的变化,探讨dl-PHPB对APP/PS1转基因小鼠学习记忆的改善作用及其可能机制。 被动回避行为学实验结果显示,与野生型对照组相比,14月龄APP/PS1转基因小鼠的跳台潜伏期明显缩短,错误数明显升高;给予dl-PHPB的转基因小鼠,与转基因对照组相比,其跳台潜伏期显著延长,错误数明显减少,说明口服dl-PHPB可以改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍。 神经电生理学实验结果显示,与野生型对照组相比,14月龄APP/PS1转基因小鼠的海马LTP水平显著降低,给予dl-PHPB后,转基因小鼠的LTP水平明显升高;并且与野生型对照组小鼠相比,给予dl-PHPB后,野生型小鼠的LTP水平也有增加的趋势。这说明口服dl-PHPB可以改善APP/PS1转基因小鼠的突触传递损伤。 分子生物学实验结果显示,APP/PS1转基因小鼠的海马组织中,NMDAR1亚基和磷酸化NR2B (Tyr1472)蛋白表达水平均有明显降低,这可能与转基因模型组动物学习记忆能力和LTP水平下降有关。口服dl-PHPB可以改善磷酸化NR2B(Tyr1472)蛋白表达水平,从而提高APP/PS1转基因动物的学习记忆能力和LTP水平。 在APP/PS1转基因小鼠的脑组织中,钾离子通道蛋白表达水平也发生了变化。在APP/PS1转基因小鼠海马组织中,与野生型小鼠相比,APP/PS1转基因小鼠的Kv3.4蛋白表达水平显著升高,并且口服dl-PHPB后转基因小鼠的Kv3.4蛋白表达水平有明显降低。 与野生型小鼠相比,APP/PS1转基因小鼠的海马组织Kir6.1蛋白表达水平有显著升高,口服dl-PHPB后,转基因小鼠的Kir6.1蛋白表达水平有明显降低,其表达水平与野生型对照组基本一致。 与野生型小鼠相比,皮层和海马组织中Kv2.1、Kv3.1的表达水平均没有明显改变,口服dl-PHPB对皮层组织Kv2.1表达有降低的趋势,但没有统计学差异。总体而言,APP/PS1遗传因素的改变并没有影响Kv2.1及Kv3.1蛋白表达水平。 以上结果显示,口服dl-PHPB可以改善14月龄APP/PS1转基因小鼠的学习记忆能力及LTP损伤,对于相关蛋白表达水平的研究提示了不同离子通道在AD病理机制中的可能作用,为阐明dl-PHPB改善学习记忆的机制提供了依据。


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