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灵芝三萜酸、喜树碱、人参皂苷合成及调控基因的筛选、克隆和功能分析

孙永珍  
【摘要】:我国药用植物种类繁多,但大多数药用植物遗传背景复杂,转录组和基因组信息匮乏,药效成分合成相关酶基因的研究较为有限。基因序列和信息的缺乏成为药用植物在分子生物学方面进行深入研究的瓶颈。表达序列标签(EST)技术与新一代测序技术的结合,为药用植物的药效成分合成相关酶基因的深入研究提供了很好的契机。通过对药用植物转录组测序,获得EST序列并对这些序列进一步发掘和筛选,得到药用植物药效成分合成的关键酶基因的候选序列。本文运用高通量测序技术对喜树(Camptotheca acuminata)、赤芝(Ganoderma lucidum)和西洋参(Panax quinquefolius)这三种重要药用植物的转录组进行了研究,并对产生的数据进行了深入分析,获得大量药效成分合成的关键酶基因的候选序列和调控基因序列,为喜树碱、灵芝酸和人参皂苷的生物合成研究奠定了基础。 喜树为珙桐科(蓝果树科)药用植物,为我国南方特有物种,是抗肿瘤、抗病毒药物喜树碱的主要来源。本研究应用第二代454GSFLX Titanium高通量测序平台对喜树幼叶的转录组进行测序,分析和筛选参与喜树碱合成代谢途径中的酶基因。主要取得以下结果:1)通过测序获得74858条高质量的EST,利用GS De novo软件组装得到30358个Unigene。通过与公共数据库进行BLAST分析,获得21213条序列的注释信息;2)获得喜树碱骨架异胡豆苷合成基因20个(共计521条EST序列),其中13个基因之前尚未报道,包括重要的香叶醇合成酶、马钱子苷合成酶和异胡豆苷合成酶基因;通过运用RACE-PCR和RT-PCR技术,对这三种酶基因进行了克隆和表达分析。结果表明,这三个基因在幼叶和叶柄中具有较高的表达水平并受茉莉酸甲酯(MeJA)和干旱胁迫诱导。细胞色素P450(CYP450)和糖基水解酶可能参与喜树碱的合成。通过筛选和表达分析,获得了7条CYP450和1条葡萄糖苷酶序列可能参与喜树碱下游支链合成。3)此外,还获得21条多药耐药基因(MDR)序列,组织表达分析后筛选到3条可能参与喜树碱转运的转运体基因序列。 赤芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌,具有增强免疫和抗疲劳的功效,其子实体中含多种灵芝酸,灵芝酸是灵芝主要药效成分之一。本实验利用第二代454GSFLX Titanium高通量测序平台对赤芝的子实体进行转录组测序,共获得479,579条reads序列,对其中419,158条序列进行拼接后获得41,068个Unigene,22,381条序列具有注释结果。通过BLAST分析,从赤芝子实体数据库中找到23条参与羊毛甾醇合成的基因序列。此外,还在Swissprot数据库的注释结果中搜索到可能参与灵芝酸下游氧化反应的CYP450基因序列171条,筛选后获得候选CYP450基因序列112条。灵芝为白腐菌,可以降解利用环境中的木质素,通过Swissprot库注释结果和BLAST搜索,共发现6条可能参与木质素降解的序列。这些序列为灵芝酸生物合成研究和木质素降解研究提供了候选的基因资源。 西洋参为多年生草本药用植物,隶属五加科人参属,其参根产生的三萜皂苷具有良好的增强免疫和抗肿瘤疗效。本文通过对西洋参的高通量转录组数据中的转录因子基因分析,筛选了可能参与调控三萜皂苷合成的转录因子基因。通过对四个公共数据库(Nr,Nt,Swissprot,Kegg)比较和关键词搜索,找到936条注释到转录因子的基因。将这些序列与植物转录因子数据库比对,发现753条序列可被注释,归为48个转录因子家族,其中包括WRKY家族的45条序列。通过MeJA处理,本文筛选到一个明显受MeJA诱导的转录因子的转录本片段,并对该转录本编码的基因对其进行了克隆,命名为PqWRKY1。通过将该基因异源转化拟南芥,表明PqWRKY1在拟南芥中的表达可以提高拟南芥中三萜物质合成基因的表达,并且提高了其对盐和干旱胁迫的耐受能力。这表明此基因在西洋参中可能参与三萜皂苷的合成和对环境胁迫的抗性。 综上所述,本文借助新一代的高通量测序平台对喜树和赤芝的转录组进行测序,获得了大量的ESTS,利用注释结果筛选到大量参与喜树碱和灵芝酸合成的候选基因。本文还对西洋参的高通量测序数据的转录因子基因进行了分析,克隆并鉴定了一个可能参与三萜和胁迫响应的转录因子基因。这些结果为药用植物次生代谢产物合成机制和调控机制的研究提供了大量的基因资源,也为中草药药效成分生物合成的应用和药用植物优良品种选育奠定了论基础。


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